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枸杞多糖体外对正常及衰老小鼠免疫细胞功能的作用及作用机理的初步研究 |
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动物中心供应。 快速老化模型小鼠(Senescence-accelerated mouse,SAM)，雌性，系日本京都大学竹田教授赠送，在本所动物实验室饲养繁殖。SAMP8和SAMR1分别为快速老化亚系和抗快速老化亚系。
1.2 药物与试剂 枸杞多糖系本所植化室从宁夏枸杞中提取的一种水溶性多糖。已明确该多糖系蛋白多糖，分子量为22～25 kD，由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、鼠李糖6种单糖成分组成，详细的结构分析尚在进行之中。RPMI 1640培养液，GIBCO产品，配制时加入青霉素100 U/ml、链霉素100 μg/ml、Hepes 10 mmol/L和谷氨酰胺2 mmol/L，使用时根据需要加入10 %～15 %的小牛血清； 环磷酰胺(Cyclophos-phamide, Cy)，上海华联制药厂；ConA为Sigma产品；3H-TdR:中科院北京原子能所，比活性20 Ci/mmol；Fura-2/AM为Sigma产品，用DMSO溶解成1 mmol/L贮备液，分装后置-20℃避光保存。
1.3 实验方法 无菌取脾制成单个细胞悬液，无菌双蒸水破坏红细胞，用RPMI 1640液洗2次，调整至需要的细胞浓度。台盼蓝染色证明细胞存活率＞90%。腹腔巨噬细胞的制备按文献［4］进行。
淋巴细胞增殖反应：3H-TdR掺入法［5］，实验孔分别加入不同浓度的LBP或（和）Con A，对照孔以培养液代替，于96孔培养板，37℃ 5% CO2饱和湿度条件下培养72 h，培养结束前10～16 h每孔加入0.5 μ Ci 3H-TdR，结果以每样本3复孔平均cpm值表示。
抗体生成细胞(PFC)检测法(溶血空斑实验)：参照文献［6］进行，略加修改。于实验前4天以10%的绵羊红细胞（SRBC）腹腔注射免疫小鼠，实验时断头处死小鼠，取脾脏制备脾细胞悬液，按常规方法测定PFC数目。或者取未经任何处理小鼠的脾脏制备脾细胞悬液(1×107/ml)，然后取脾细胞悬液1 ml，1% SRBC 60 μl和RPMI 1640液配制的不同浓度的LBP，加入24孔培养板中，总培养体积2 ml，在上述相同培养条件下培养4 d，于第5天测定PFC数目。
细胞内游离 Ca2+ 浓度［Ca2+］i测定：Fura-2/AM双波长荧光法，参考文献［4,7］进行。药物与脾细胞或腹腔巨噬细胞作用2～3 min时测定［Ca2+］i。
2 结 果
2.1 LBP体内给药对Cy处理小鼠脾抗体生成反应的影响 LBP剂量为5 mg/kg，连续给予7 d(sc.)，做PFC实验，实验前5 d 1次给予Cy(sc. 50 mg/kg)。实验结果表明，LBP(5 mg/kg)对Cy所诱发的抗体生成反应低下具有明显的改善作用，见表1。
表1 LBP对Cy处理小鼠脾抗体生成反应的影响
Tab.1 The effect of LBP on splenocyte antibody production response in Cy-treated mice
Group Doses(mg/kg) PFC/106 cell(±s)
N.S-CON / 1 038±91
Cy-CON / 535±961)
Cy-LBP 5 937±302)
Note：1)P＜0.01 vs N.S-CON；2)P<0.01 vs Cy-CON,t test, n=3
2.2 LBP体外对LACA小鼠脾细胞增殖反应的影响 由表2可以看出，在加ConA和不加ConA两种条件下，在50～100 μg/ml剂量范围内，LBP均使3H-TdR掺入明显增加，说明LBP在体外不仅可以促进Con A诱导的脾细胞增殖反应，而且可以直接刺激脾细胞增殖，具有直接激活小鼠脾细胞增殖的作用。
表2 枸杞多糖（LBP）对LACA小鼠脾细胞增殖反应的影响
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