噬菌体表达短肽模拟脂多糖类脂A表位的研究

鲍永利　富　宁　杨贵贞　于春雷　王　莉　

　　中国图书分类号　R378　R392-33
　　摘　要　目的：得到拟类脂A的六肽。方法：用抗类脂A的单克隆抗体筛选噬菌体随机六肽库，经四轮筛选后进行ELISA检测,用得到的15个阳性克隆分别免疫小鼠，并将使小鼠产生抗LPS抗体的10个克隆进行测序，将保守序列进行肽合成。结果：得到保守序列为Lys-Phe-Ser-Ser-Arg,即KFSSRX。固相合成此小肽可与其1B6抗体结合，且此结合可被LPS抑制。结论：此六肽可模拟脂多糖或类脂A表位。
　　关键词　脂多糖　模拟短肽　噬菌体肽库

Preparation of peptides mimicring lipid A epitope using phage display peptide library

BAO Yong-Li, FU Ning①, YANG Gui-Zhen et al.
Department of Immunology, Norman Bethune University of Medical Sciences, Changchun 130021. ①　Department of Immunology,First Military Medical University，Guangzhou 510515

　　Abstract　Objective:Finding mimic Lipid A 6-mer peptides.Methods:Used anti-Lipid A McAb to fish out phage display 6-mer peptide random library.After 4 rounds selection,15 positive clones were detected by ELISA and used to immunize mice.Ten of them could get antibody for LPS.To analyze the DNA sequences and to synthesize the peptide from conservative sequences.Results:The conservative amino acid sequence is Lys-Phe-Ser-Ser-Arg or KFSSRX.The solid phase synthesis peptide can bind to 1B6 antibody and this binding can be inhibited by LPS.Conclusion:These results suggest that 6-mer peptide can mimicry the epitope of LPS or Lipid A.
　　Key words　LPS　Mimic peptide　Phage display peptide library

　　已知细菌脂多糖为非胸腺依赖抗原，难以诱导有效的免疫回忆反应，90年代初曾有人用抗独特型抗体成功地模拟了脂多糖表位，提示了用蛋白或多肽模拟脂多糖的可能性。从噬菌体肽库中筛选目的短肽是近年来发展起来的一项新技术，是研究蛋白质分子之间相互作用的一个有效工具。本研究用具有交叉反应性的抗鼠伤寒杆菌脂多糖类脂A单克隆抗体筛选噬菌体随机六肽库，旨在得到可模拟脂多糖类脂A表位的短肽，为研制具有胸腺依赖性抗原性质的LPS疫苗及内毒素拮抗剂奠定基础。

1　材料与方法
1.1　材料　噬菌体随机六肽库及大肠杆菌K91Kan均为美国密苏里大学Smith博士惠赠；T7DNA聚合酶测序试剂盒购自Promega公司；32P-dATP购自北京亚辉公司；抗类脂A单抗1B6为IgG1亚类系本室自制，方法见文献［1］；豚鼠抗野生型M13噬菌体抗体为本室制备。
1.2　噬菌体六肽库的筛选　亲合素包被全塑培养皿，4℃过夜，1%BSA封闭，4℃ 1 h，加入生物素化单克隆抗体1B6室温2 h，加肽库，4℃作用1 h洗去未结合的噬菌体，用洗脱液解离已结合的噬菌体，侵染K91Kan，扩增并提取噬菌体，用于下一轮筛选。共进行4轮筛选，每一轮都不断减少生物素化单抗的用量及单抗与肽库作用时间旨在得到高亲和力，特异性强的克隆。四轮筛选后挑选单斑扩增，PEG沉淀回收噬菌体，并测其滴度，详见文献［2］。
1.3　夹心ELISA法筛选阳性噬菌体克隆　用1B6包被酶标板，1％BSA封闭后加筛选出的噬菌体克隆，

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