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大肠杆菌菌株 衍生噬菌体 PBR322衍生质粒作为人IL |
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狄凯军 刘世广 章秋珩 章静波
(中国医学科学院中国协和医科大学基础医学研究所，北京100005)
摘 要 为探索人白细胞介素-6(IL-6)在原核细胞中高效表达的途径，选用BL21(DE3)/PET-28作为表达系统，以聚合酶链反应(PCR)技术扩增了hIL-6的互补DNA(cDNA)的编码区，引入了EcoRI和Hind Ⅲ位点。用限制性内切酶EcoRI和Hind Ⅲ酶切后，克隆于PET-28载体的相应位点，转化DH5α。选出阳性克隆，经DNA序列分析，表明其编码区内无非特异突变。将重组质粒转入DH5α，筛选阳性克隆，用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达。全细菌裂解液进行十二烷基黄酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，结合固化蛋白质的免疫学测定(Western-blot)杂交进行分析。结果表明：Western-blot杂交发现有与抗IL-6特异结合的蛋白带，以4h的产量最多，激光扫描显示IL-6的吸收峰占总吸收面积的37%(4h诱导)。分子量约为27kD。实验显示，人IL-6在原核细胞中实现了高效表达，表达产物具有IL-6的免疫活性。
关键词 白细胞介素-6(IL-6) 大肠杆菌(λ衍生噬菌体)［BL21(DE3)］ 聚合酶链反应(PCR)
白细胞介素-6(IL-6)是一种多功能的细胞因子，具有多种生物学作用，诸如诱导T淋巴细胞和B淋巴细胞增殖和分化，增强CTL和NK细胞的杀伤活性；协同刺激造血细胞的分化和血细胞的生长［1］；诱导神经细胞的分化［2］，并具有明显的抗病毒和抗肿瘤作用［3］等。为探索人IL-6在原核细胞中高效表达的途径，本实验采用大肠杆菌菌株(λ衍生噬菌体)BL21(DE3)原核表达体系，为进一步研究其功能、应用及产量提供先期资料。
材料和方法
1.菌株与质粒
菌株BL21(DE3)、DH5α为本室冻存；表达载体PET-28a(+)为中国医学科学院基础所郑德先教授惠赠；PUC13-IL-6由日本大阪大学Taga教授惠赠。
2.引物设计、合成与聚合酶链反应(PCR)扩增
根据成熟IL-6编码序列设计一对引物：
P1中含EcoRI酶切位点，ATG起始密码和成熟hIL-6的5 端部分氨基酸编码序列；P2中含HindⅢ酶切位点、TAA终止密码和hIL-6的3 端部分氨基酸编码基因的互补序列。以PUC-13-IL-6为模板，常规进行PCR反应。
3.表达质粒的构建及鉴定
用LMP法回收PCR产物，分别用限制性内切酶EcoRI、HindⅢ酶切PCR产物和载体PET-28a(+)，然后进行连接反应，用连接产物转化感受态菌DH5α，筛选阳性克隆，提取质粒，进行酶切鉴定。
4.DNA序列测定
采用美国应用生物系统公司(ABI)的373ADNA序列测定自动分析仪，用Tag酶标记T7引物，以PCR方法进行测序反应。
5.诱导质粒PETIL-6表达
将重组质粒转化BL21(DE3)，挑出一新形成的克隆，于37℃活化表达克隆，再以1∶25接种于LB培养基扩增至菌密度OD600=0.6,加入1mmol/L进行诱导表达，分别于1h、2h、4h、7h取样，冰上放置5 min，4℃，8 000r/min离心，收集菌体。
6.SDS-PAGE凝胶密度扫描和Western-blot分析
于收集的菌体中加入1×SDS凝胶加样缓冲液100μl，100℃煮沸3 min，取15μl进行SDS-PAGE［4］，浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为15%。电泳结束后考马斯亮蓝染色。凝胶密度扫描测定蛋白含量。Western-blot分析方法见文献［4］。应用鼠抗IL-6McAb及HRP标记羊抗鼠IgG抗体。
结果和讨论
1.常规PCR扩增
采用合成的引物，以PUC13-IL-6为模板，进行常规PCR扩增。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，出现1条0.56kb大小的带。
2.表达载体PETI的构建
PCR扩增的人完整IL-6编码基因经EcoR I和Hind Ⅲ双酶切后与相同酶解的PET-28a(+)体外重组，转入E.coli DH5α中。转入的克隆经小提质粒及限制性内切酶分析，证明编码完整的[1] [2] 下一页
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