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卵丘细胞及胞外基质诱发中国仓鼠精子顶体反应 |
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袁玉英 张振汉** 石其贤
(浙江省医学科学院药物研究所生殖生理学研究室，杭州 310013；
**宁夏农学院生物学系，银川)
摘 要 为了探讨中国仓鼠(CHA)卵丘细胞及其胞外基质(COM)和细胞外基质(ECM)对精子获能、顶体反应(AR)和受精能力的作用，以及COM中何种因子影响上述受精环节，分别采用阿利新蓝8 GX法和放射免疫法(RIA)测定COM中糖胺多糖(GAG)总量和孕酮(P4)含量，并以精子穿卵试验(SPA)评价精子的受精能力。结果表明：CHA精子在COM中AR率随获能培养时间的延长而增加，呈时间依赖关系。ECM是诱发CHA精子AR的主要部位。它含P4、透明质酸(HA)和肝素(HE)等。它们均可引起CHA体外获能精子发生AR，AR率随P4和GAG剂量而增加，并存在着明显的量效关系。P4不能引起未获能精子发生AR，据此，它可以作为一种评价精子是否获能的探针。此外，P4还可明显地提高CHA精子穿卵能力。由此可得出结论，ECM中P4和GAG是引起CHA精子获能、AR和受精的因子。
关键词 卵丘细胞及胞外基质 孕酮 糖胺多糖 顶体反应 中国仓鼠精子
绝大多数哺乳动物新排出的卵子，其外层由多层卵丘细胞(cumulus oophorus cells,COC或cumulus cells,CC)及细胞外基质(extracellular matrix,ECM)构成。我们将它通称为卵丘细胞及其胞外基质(cumulus oophorus and matrix,COM)。ECM是在卵母细胞减数分裂重新启动期间，为排卵前迅速膨胀的COC所分泌［1］，在电镜下，完全膨胀的ECM象一张纤维构成的网络，它可伸入透明带(ZP)外层的微孔中［1］。近几年来，COM在哺乳动物受精中的作用日益引起人们的重视［2～4］。据这些作者报道，COM的存在对体外受精具有促进作用。含COM的卵子受精率明显增高而且稳定(85%～100%)；而无COM的卵子受精率明显下降并且波动较大(10%～80%)［1］。因此，COM的存在对于提高和稳定受精率具有十分重要的意义。COM提高受精率是通过精子获能还是顶体反应(AR)，或是直接作用于受精阶段，尚不了解。然而，某些种类(如羊等)的卵子，在体内、外没有完整的COM时仍能受精。因此，一些学者认为，受精过程并不需要COM。
近几年来，Yanagimachi等［1］和Shi等［5］发现中国仓鼠(CHA)体外受精完全依赖于其自身COM之存在。在缺乏COM时，几乎不能受精。因此，CHA是研究COM与受精关系较为理想的动物模型。但他们并未分析COM中存在着何种物质或因子支持精子受精?因此，本研究的目的是：(1)探讨CHA的COM分别对精子获能、AR和受精能力的作用；(2)分析COM中何种物质或因子影响精子获能、AR和受精能力?这一研究可望发展一种简易的评价精子获能和AR的分子探针。
材料和方法
1.培养基
所有无机盐试剂(分析纯)均购自上海化学试剂一厂。孕酮(P4)、糖胺多糖(GAG)、透明质酸、BSA、丙酮酸钠、乳酸钠、forskolin、dbcAMP、肝素、牛磺酸、阿利新蓝8 GX和肾上腺素等购自Sigma化学试剂公司。CHA配子培养基采用改良的Tyrode液(mTS)，含15 g/L BSA，0.5m mol/L牛磺酸和0.5m mol/L肾上腺素等。该培养基可使CHA精子体外获能但不能引起精子AR［5］。孕马血清(PMSG)为长春生物制品研究所产品，人绒毛膜促性腺激素(hCG)为浙江宁波激素制品厂生产。
2.精子和卵子
采用6月龄雄性中国仓鼠(Cricetulus griseus,CHA)。部分动物为四川省计划生育科学技术研究所黄天华教授惠赠；部分动物购自北京国家计划生育委员会科学技术研究所。以颈椎脱臼法处死动物后，打开腹腔，取出输精管和附睾尾部精子，合并后悬浮于mTS(pH7.6)中，在5%CO2和95%空气条件下，以上游法(精液：mTS为2：10，孵育30min)筛选活动精子。收集上层精子悬液，并将精子数调至5～6×106细胞/ml。
采用4月龄雌性CHA，卵子超排采用改良的仓鼠超排卵法，即在动情期第1d上午9时腹腔注射30 IU PMSG，56～60h后注射30 IU hCG。于注射hCG23～24h后在预期排卵前12h，施人工授精。然后从输卵管壶腹部收集输卵管液(ampullary fluids,AF)、卵子及其COM，总计精子583(其中在AF中383，位[1] [2] 下一页
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