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卵丘细胞及胞外基质诱发中国仓鼠精子顶体反应 |
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于COM中150和ZP上50)。金黄仓鼠(GH)卵超排按本实验室报道方法［6］。
3.精子获能及评价
精子与超排卵子在含/无COM或金黄仓鼠卵丘细胞及胞外基质(GHCOM)存在情况下，置37℃ 5%CO2和95%空气培养1～30h。在不同时距(0、1、3、5、7和30 h)用压片法［6］置相差显微镜(Olympus BH2)观察精子活率、超激活运动(HAM)和AR%。以AR%为指标评价群体精子获能状况。
图1 COM、ECM和CC对中国仓鼠精子顶体反应的影响
COM.卵丘细胞及其细胞外基质.ECM.细胞外基质 CC.卵丘细胞
Fig.1 Effect of COM,CC and ECM on the AR in CHA spermatozoa.
COM：cumulus oophorus and matrix
ECM:extracellular matrix
CC:cumullus cells
4.精子顶体状态的评价方法
在相差显微镜下，CHA精子顶体帽可分为两种类型：(1)顶体帽完整而紧密，外形光滑，顶体吻端有明显的钩；(2)AR精子，顶体帽缺如。体内、外AF、COM和ZP上精子顶体状态的评价：收集壶腹AF和卵子及其COM，在相差显微镜下观察上述诸部位的精子顶体帽状况。具体操作见文献报道方法［6］。
5.COM中P4的测定
收集40只CHA超排卵后的COM约0.5ml，经37℃1h孵育后离心(14 000×g,15min)，除去CM后得到ECM0.3ml，取0.2ml测定P4；另0.1ml测GAG。同时取0.3ml混合血浆，然后根据WHO人类生殖规划处提供的RIA配对试剂，按WHO RIA测定手册(1985，第9版)操作，采用内标准法测量，回收率达90%。高、中、低浓度质量控制的批内变异系数分别为12.3%、8.8%和6.6%。批间变异系数分别为6.6%、8.0%和9.1%，均符合测定技术要求。
6.GAG的测定
按刘秉慈报道的阿利新蓝法测定GAG总量，将阿利新蓝8 GX按1.4g/L(w/v)溶解于0.5mol/L乙酸钠溶液中，临用前配制。然后于试管中加入0.1 mlCOM或GAG，空白对照管中加0.1ml去离子水。准确加入1.5ml阿利新蓝，在vortex上充分混匀。10min后，在721光电比色计上用1.0ml比色杯(波长480nm)进行比色测定。然后经常规醋酸纤维膜电泳法分离GAG中的相对含量［7］。
7.CC与ECM的分离
为了探讨诱发AR因子是在卵CC中还是ECM中，将COM置于0.2μm(φ)微孔滤膜(国家海洋局第二海洋研究所，杭州)制成的袋里，悬挂于含CHA精子悬液的试管中(图1)，于37℃, 5%CO2, 95%空气中培养7h或COM经37℃孵育后离心(14 000g,15min)，将CC与ECM分离。CC经mTS离心洗涤3次，然后将CC和ECM分别置于微孔滤膜袋中，按上法培养7h。最后分别评价COM、CC和ECM对精子AR的作用。
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