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全自动荧光标记DNA测序法检测利福平耐药结核杆菌rpoB基因突变 |
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金玲 康熙雄 鱼瑛 王淑华 马琳
为研究我国分离的结核杆菌临床分离株利福平(Rifampin,RFP)耐药表型与rpoB基因突变的关系，应用全自动荧光标记DNA测序方法对7株RFP耐药株及1株RFP敏感株的rpoB基因突变集中区域进行了序列分析，并与欧美日文献报道结果做了对比。
8株结核分枝杆菌临床分离株获自北京市结核病胸部肿瘤研究所，其中1株RFP敏感，3株RFP低度耐药(耐药标准为50μg/ml),4株RFP高度耐药(耐药标准为250μg/ml)。7株RFP耐药菌株对其它抗结核药物异烟肼，链霉素及乙胺丁醇有不同耐药表型。提取菌株DNA，用聚合酶链式反应(PCR)对rpoB基因突变高发区进行扩增，PCR反应引物：上游引物5'-AAGGAGTTCTTCGGCACCAG-3'，下游引物5'-GGTTTCGATCGGGCACATCC-3'，扩增片段长183bp。PCR反应产物于大连宝生物公司在ABI-377型全自动荧光DNA序列分析仪上进行检测。结果：RFP敏感菌株证实无rpoB基因突变，所有7例RFP耐药的结核杆菌临床分离株均发生rpoB基因碱基置换突变，4株为531 Ser→Leu，1株为531 Ser→Glu,2株为526 His→Tyr,其突变位点与耐药程度及模式间无相关关系。
近年对结核杆菌RFP耐药分子机制研究表明，RFP耐药菌株多发生rpoB基因突变，95%以上位于69bp长区域内，并以531aa及526aa位点突变居多。本文结果得出了2个主要氨基酸突变位点(531及526)，与文献报道发生区域及位点突变形式完全吻合，证明我国分离出来的结核杆菌RFP耐药株与欧日美报道耐药机制相似。荧光标记自动DNA测序对rpoB基因进行序列分析具有简便、快速、准确等优点，可以明确突变性质，从而判断出RFP耐药性，确定有无多耐药菌株感染。如果降低检测费用，则可作为临床标本结核杆菌对利福平耐药性的常规诊断检测。
作者单位：金玲 康熙雄（130061 长春，白求恩医科大学第三临床学院 检验科 中日联谊医院）
鱼瑛 王淑华（长春职工医科大学）
马琳（白求恩医科大学基础医学院微生物教研室）
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