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大肠杆菌菌株 衍生噬菌体 PBR322衍生质粒作为人IL |
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人IL-6基因插入质粒PET-28a(+)的EcoRI和Hind Ⅲ酶切位点之间(图1)。
图1 克隆的酶切鉴定 M.分子量标记 C.经EcoRI和Hind Ⅲ双酶切的克隆质粒
Fig.1 Restriction enzyme screening of colony M:Molecular marker of Hind Ⅲ digested Lamda DNA C:EcoRI and Hind Ⅲ digested plasmids of colony
3.DNA序列测定
PET-28a(+)-IL-6质粒DNA序列分析证明，IL-6全长编码区内未发现核苷酸突变，引入了ATG启始密码和TAA终止密码。
4.PETI的诱导表达及Western-blot分析
将重组质粒转入BL21(DE3)，IPTG诱导后不同时间收获的菌体与相同培养的菌体对照一起进行SDS-PAGE及Western-blot分析，结果显示诱导的BL21(DE3)/PETI裂解物中确实存在能特异地与抗IL-6 McAb结合的蛋白，分子量为27kD(图2)，表明目的基因已被成功地诱导表达，其产物的抗原性与人IL-6相同。凝胶密度扫描分析证明，表达的人γIL-6蛋白占总菌体蛋白的31%。活化扩增的同一阳性克隆经IPTG诱导1h即有少量人γIL-6表达，表达产物随诱导时间的延长而增加，诱导4h达峰值，继续延长诱导时间，人γIL-6蛋白表达量反而下降。细菌生长状态研究提示，当BL21(DE3)生长菌密度至0.6时，人γIL-6诱导表达产率较高。
图2 Western blot分析结果 M.蛋白分子量标记 1.BL21(DE3)阴性对照 2.未经诱导的样品 3.诱导1h后的样品 4.诱导2h后的样品 5.诱导4h后的样品 6.诱导7h后的样品 7.诱导4h后的样品经Western-blot分析
Fig.2 Western blot analysis M.Protein Molecular Marker 1.BL21(DE3) 2.samples collected immediately before induction3.sample collected 1h after induction 4.sample collected 2h after induction 5.sample collected 4h after induction 6.sample collected 7h after induction 7.Western-blot of samples collected 4h after induction
PET表达体系是目前在大肠杆菌中克隆和表达融合蛋白的最佳体系之一［5］，本实验选用BL21(DE3)/PET28作为表达体系有许多优点：(1)PET-28a(+)使用T7Lac启动子，其上游的LacI编码足够的Lac抑制子，阻断T7RNA聚合酶的产生和其对外源基因的转录，使基础表达水平降到最低，可提高重组质粒的稳定性。(2)PET-28的BamHI下游含有转录终止信号，阻止通读，转录的mRNA3 -尾形成二级环状结构，可阻止降解，延长寿命。(3)BL21株缺乏OmpT外膜蛋白酶，有利于防止表达产物在提纯时降解。(4)携带T7RNA聚合酶基因的噬菌体DE3已整合于细菌基因组，可通过IPTG诱导使之表达，进而启动T7Lac启动子，开始目的基因转录和翻译。(5)PET-28含有His.Taq寡聚组氨酸链，因而在多种情况下都可以便利经济地进行纯化。这一系统特别适合表达对细菌有毒性的外源蛋白。
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