Toll样受体4在乙型肝炎组织及细胞株 HepG2 HepG2 2 15内的表达特征

　　1.2.5 培养细胞的TLR4表达检测 采用直接免疫荧光流式细胞术。2种细胞株各收集4管，DMEM悬浮细胞，1~5 × 106/mL。检测前PBS洗涤细胞，分别加入PE-anti-TLR4抗体(美国Ebioscience公司)10 μL和细胞100 μL，设同型对照，以PE-mouse IgG 2a(美国Ebioscience公司)10 μL代替PE-anti-TLR4抗体，震荡充分混匀，按常规方法室温、避光孵育20 min。以PBS常温1000 g离心5 min洗涤 1次后，以PBS配成约106/mL液，用FCM及Cellquest软件检测并分析TLR4的平均荧光强度及阳性细胞率(采用BD FACS Calibur 流式细胞仪)。以上实验重复2次。

　　1.3 统计学分析

　　使用SPSS 12.0统计软件，相关分析采用Spearman等级相关分析，各组间的多重比较采用列联表分析，两组间计量资料采用t检验，取?琢=0.05。

　　2 结 果

　　2.1 TLR4在慢性乙型病毒性肝炎患者肝组织上的表达

　　TLR4在CHB肝组织上主要表达于肝细胞胞浆及部分胞膜上，细胞核及汇管区无表达，与健康对照组相比，TLR4的表达明显增强(P< 0.01，见图1A~C)，免疫组化染色强度与肝组织炎症活动度的分级(G)呈显著正相关(r=0.632，P< 0.001)，除G3组与G4组之间无显著性差异外，余各G组之间均有显著性差异，见表1。

　　2.2 TLR4在慢性重型肝炎肝组织上的表达

　　TLR4在CSH肝组织上主要呈小灶性表达，大片坏死区基本无表达，与健康对照组相比，TLR4的表达明显增强(P< 0.05，图1D)，但低于CHB组G2、G3、G4级的表达(P< 0.05)，与G1级的表达无显著性差异。

　　2.3 TLR4在CHB肝组织上的表达与其他临床指标的关系

　　TLR4在CHB肝组织上的表达与其他临床指标，包括纤维化程度的分期(S)，肝组织HBsAg、HBeAg免疫组化染色强度、血HBV-DNA定量，AST、ALT、ALB、TBILI、PT等肝功能指标均无显著性关系(r=0.033～0.273，均为P >0.05)。

　　2.4 TLR4在HepG2及HepG2.2.15上的表达

　　TLR4在肝癌细胞株HepG2.2.15上表达的平均荧光强度为18.24±8.18(n=12)，明显高于在肝癌细胞株HepG2上表达的平均荧光强度2.33 ± 0.41(n=12，t′=6.729，P< 0.001);而TLR4+的阳性细胞率，在HepG2.2.15上为(17.79 ± 9.46)%，亦明显高于HepG2的阳性细胞率(1.71 ± 0.77)% (t′=5.870，P< 0.001)。

　　3 讨 论

　　目前所知，免疫介导的肝损伤是慢性乙型病毒性肝炎发病的主要机制，HBV感染后，细胞毒性T细胞(Tc)、辅助性T细胞(Th)、库普弗细胞、自然杀伤细胞等各种免疫细胞均被激活，释放TNFα(tumor necrosis factor α)、IFNγ(interferon γ)、IL-2(interleukin-2)、IL-6(interleukin-6)等细胞因子，从而对肝脏造成损伤，故研究免疫损伤的具体机制及寻找有效且副作用小的免疫治疗方法一直是慢性乙型肝炎治疗的热点及难点。

　　TLR是连接天然免疫及获得性免疫系统的重要桥梁[1]，其中TLR4是该家族中目前研究得较清楚的成员，它主要表达在巨嗜细胞、中性粒细胞、树突状细胞及内皮细胞上，它识别PAMPs或相关内源性配体后，通过髓样分化因子88依赖性信号传导途径(MyD88)，可引起细胞因子如IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、TNFα及IFNγ等的合成与释放，促使免疫细胞成熟、分化和功能化，并在部分研究中提示TLR4能促进机体对病毒的清除[2]。

　　正常肝脏是人体各组织中表达TLR最低的器官之一[5]，新近细胞研究显示，某些炎症或前炎性因子如细菌脂多肽、IL-la、TGF-β可以上调肝细胞TLR表达。在与病毒性肝炎相关性的研究中，Machida等[6]的研究发现，在感染HCV的Raji细胞系中，TLR4的表达有明显的升高，而在感染HCV的患者外周血单个核

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