Toll样受体4在乙型肝炎组织及细胞株 HepG2 HepG2 2 15内的表达特征

　　【关键词】 TLR4; 乙型病毒性肝炎; 免疫组化; 流式细胞术

　　[J SUN Yat-sen Univ(Med Sci), 2007, 28(3):284-287] 目前认为，乙型肝炎病毒侵入人体后，免疫介导的肝损伤是乙型病毒性肝炎发病的主要机制。Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)，是近年来发现的I型跨膜蛋白质，已有10余个家族成员，它可通过识别病原相关的分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，引发信号传导导致炎症介质的释放，在天然免疫防御中起重要作用，并最终激活获得性免疫系统[1]。部分研究显示，TLR4等在某些病毒感染的疾病过程中有重要作用[2]。本研究通过检测乙型病毒性肝炎患者肝组织，肝癌细胞株HepG2和HepG2.2.15细胞TLR4的表达，探讨TLR4与乙型病毒性肝炎的相关性。

　　1 材料和方法

　　1.1 研究对象

　　标本取自2003年6月至2006年2月中山大学附属第三医院部分住院病人共74例，男性69例，女性5例，平均年龄36(16~52)岁，其中慢性乙型病毒性肝炎组(chronic viral hepatitis B,CHB)为肝穿刺标本，共63例，慢性重型肝炎组(chronic severe hepatitis ,CSH，乙型)为肝移植病肝切除标本，11例。另设健康对照组，标本取自肝移植移植肝常规留取标本，10例。均行常规石蜡包埋连续切片。诊断符合2005年《慢性乙型肝炎防治指南》及2000年《病毒性肝炎防治方案》[3，4]。

　　1.2 方法

　　1.2.1 肝组织病理切片的TLR4表达检测 采用Elivision二步法进行免疫组化染色(Elivision二步法试剂盒购自福州迈新公司)，具体步骤参照试剂盒推荐步骤进行，一抗为anti-TLR4 PcAb(兔源性，美国Santa Cruz公司)，稀释度为1 ∶ 100，DAB显色，用柠檬酸高温高压法进行抗原修复，设立阴性对照，以PBS代替一抗。

　　1.2.2 诊断方法 所有病理切片均行HE、网状纤维染色及HBsAg、HBeAg免疫组化染色(SABC法)以辅助慢性乙型肝炎肝组织炎症活动度的分级(G)、纤维化程度的分期(S)的诊断，诊断标准参照2000年《病毒性肝炎防治方案》[2]。

　　1.2.3 免疫组化结果的判断 采用综合评分法(由研究者及1名病理师分别阅片评分)。阳性着色呈棕色细颗粒状。凡细胞质或细胞核浅棕色为1分、棕色为2分、深棕色为3分、不着色为0分;在高倍镜下随机计数5个视野，计算阳性细胞所占百分比，阳性细胞占所有细胞的比例：≤10%为0分，11%~25%为1分，26%~50%为2分，51%~75%为3分，≥76%为4分。根据上述2项指标的两积分相乘分为4级：0分为阴性(-)、1~4分为弱阳性(+)、5~8分为中等阳性(++)、9~12分为强阳性(+++)。

　　1.2.4 细胞培养 肝癌细胞株HepG2及HepG2.2.15(中山大学附属第三医院传染科实验室保存)培养液为含10%灭活新生牛血清的DMEM培养基(GIBCO公司)，HepG2.2.15细胞培养液另加G418

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