谷氨酸脱羧酶通过调节T细胞亚群预防NOD小鼠发生1型糖尿病

　　四、GAD免疫后脾脏T淋巴细胞亚群的变化

　　脾脏淋巴细胞测定结果显示，对照组与GAD组的T细胞CD+4　亚群分别为　 78.35±10.11与30.75±14.79(P＜0.01)，CD+8亚群分别为22.16±11. 04与69.48±14.81(P＜0.01)，CD+4/CD+8亚群比值，[ QS) 分　别为　3.34±2.83　与　0.31±2 .83(P＜0.01)。对照组的T细胞以CD+4亚群为主，而CD+8亚群比例 低；GAD组则以CD+8细胞亚群比例升高，CD+4/CD+8亚群比值明显下降。

　　五、GAD免疫后胰岛浸润淋巴细胞的免疫组织化学改变

　　用CD4、CD8单抗对两组胰腺免疫组化染色的结果表明，与外周淋巴器官有CD+4T细 胞增生性反应一样，对照组的胰岛炎症细胞也几乎全部为CD+4的T细胞，大量分布于胰 岛周围及内部；GAD组浸润胰岛的CD+4T细胞数量明显减少，且分布限于胰周。两组的CD 8细胞染色均为阴性。

　　讨　　论

　　本研究给予4周龄雌性NOD小鼠腹腔注射纯化猪脑GAD，在20周的观察期内，可保护绝大多数( 90%以上)小鼠不发展为糖尿病，且胰岛炎症程度显著减轻；而单独注入FIA则对糖尿病发病 无明显影响；胰岛病理学结果显示GAD预免疫组小鼠的胰岛数目保存较好，且胰岛炎症被局 限在胰周；而对照组胰岛绝对数目减少，炎症出现率100%，且其中80%以上为二、三级胰岛 炎 。这与国外报道一致〔2-6〕，提示早期应用GAD具有预防NOD小鼠DM发病的作用。另 外，本研究在国内外首次对FIA对照组及GAD组胰腺进行了电镜观察，结果显示胰岛β细胞的 分泌颗粒、内浆网、核膜等超微结构得到了保护，不象对照组的胰 岛β细胞有分泌颗粒减少、空泡样变和内浆网及核膜扩张、核糖体脱颗粒等异常变化。上述 结果提示GAD预免疫不仅可预防NOD小鼠糖尿病发病，防止胰岛细胞的胰岛炎等其它自身免疫 现象，且可保护β细胞的超微结构，即使在应用环磷酰胺加速的情况下也如此。

　　近几年随着对1型DM动物模型(如BB大鼠和NOD小鼠等)和患者进行的大量基础研究，大大加深 了对1型DM病因和发病机制的认识。现认为1型DM的发病包括辅助T细胞(CD+4Th细胞) 活性增强和抑制性T细胞(CD+8Ts细胞)缺陷两个方面。这造成免疫调节失控和细胞因 子 不平衡，以分泌IL-2、IFN-γ等因子的Th1细胞占优势，从而使免疫反应扩大 〔8〕。本研究表明，在FIA对照组的外周淋巴器官脾脏中及胰岛炎症细胞中，不管是否 用环磷酰胺加速，皆自发性存在CD+4T细胞比例增多而CD+8T细胞亚群降低反应，这 与以前 报道的NOD小鼠1型DM发病为CD+8的Ts细胞亚群缺陷一致；用GAD免疫的小鼠脾组织中 淋巴细胞则以CD+8T细胞亚群为主，CD+4/CD+8亚群比例下降甚至倒转；免疫组 化结果直观地显示对照组胰岛浸润的淋巴细胞绝大多数为CD+4T细胞，提示该细胞可能 直接参与了β细胞的损伤过程；而GAD组胰腺组织中的CD+4T细胞数减少；这提示注入提 纯猪脑GAD预防NOD小鼠发生DM的机制之一，可能与恢复Ts(CD+8)细胞的功能、抑制 CD+4T细胞(Th)的增生及活动，使免疫抑制作用加强，从 而纠正免疫失控状态有关。这使T细胞介导的自身免疫性β细胞损坏过程中断，从而保护了 β细胞。由于环磷酰胺加速糖尿病的机制在于：(1)取消Ts细胞的功能；(2)使CD+4T h亚群向Th1方向分化，IFN-γ产生增加，介导针对β细胞的细胞免疫反应〔9 〕。故外源性GAD在影响NOD雌性小鼠自发性自身免疫反应的同时，也可能通过上述机制拮 抗环磷酰胺的致糖尿病作用。

　　人类新发病的1型糖尿病患者中，70%左右可检测到GAD65 Ab和T细胞增生的反应〔 1，10，11〕，针对胰岛GAD的反应最早出现在疾病临床发病前几年甚至十几年〔2〕 ，然 而，目前尚不清楚对GAD的免疫反应是β细胞破坏的原因还是结果，本研究也表明早期给予 含GAD65和GAD67两种分子形式的GAD，可几乎完全中止针对胰岛的细胞免疫反应，反过来提 示GAD自身免疫反应在NOD小鼠DM早期的发生发展中可能起启动作用。因此，用不同种类和来 源的GAD预先对NOD小鼠免疫，皆可预防或延缓其糖尿病发病，而用其他β细胞抗原如ICA512 (IA-2)早期注入却无此保护作用〔1〕，这提示GAD是参与NOD小鼠糖尿病早期发病机 制的一个关键靶抗原。但外源性GAD注入也可能不被机体耐受，反而诱使糖尿病发生或加重 〔12〕。本研究表明20周龄时对照组NOD小鼠血 中GAD-Ab阳性率与GAD组无明显差

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