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从猪脑中提取纯化谷氨酸脱羧酶的研究 |
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杨金奎 陈家伟 何戎华
【摘要】 目的 从猪脑中提取纯化谷氨酸脱羧酶(GAD)，用于1型糖尿病患者GAD抗体的测定。方法 以猪脑制备GAD粗酶，经Sephadex G100、DEAE-Sephacel和羟基磷灰石凝胶层析分离纯化，结合十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定相对分子质量、同位素法测定GAD酶活性，建立了GAD纯化方法。结果 GAD粗酶经纯化后的单位蛋白量的酶活性增加了118倍。经SDS-PAGE分析，为一条相对分子质量约64 000的蛋白条带。结论 用多步层析分离法从猪脑中提取纯化GAD是一种简便可行的方法。
【关键词】 谷氨酸脱羧酶 纯化 糖尿病，1型 凝胶层析
Purification and identification of glutamic acid decarboxylase from porcine brain
YANG Jinkui,CHEN Jiawei,HE Ronghua.
Department of Endocrinology,the First Affiliated Hospital,Nanjing Medical University,Nanjing,210029
【Abstract】 Objective To purify glutamic acid decarboxylase (GAD) from porcine brain for the sake of detecting GAD antibodies in patients with type 1 diabetes mellitus. Methods GAD was obtained from porcine brain as a crude extract and purified by using Sephadex G100, DEAE-Sephacel and calcium phosphate chromatography. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and GAD activity assay were adopted to identify this purified enzyme. Results With this method, specific activity of GAD increased by 118-fold and it consisted of a single band around 64000 on SDS-PAGE. Conclusion It is a simple and useful method to purify GAD from porcine brain by multi-step chromatography.
【Key words】 Glutamic acid decarboxylase Purification Diabetes mellitus, type 1 Gel chromatography
1型糖尿病是一种自身免疫性疾病。患者血清中可存在多种与1型糖尿病发病有关的自身抗体。其中，64kD抗体(群)(64kD antibodies, 64kAs)，谷氨酸脱羧酶(GAD)抗体对于1型糖尿病的预测及早期诊断和鉴别诊断具有重要的临床应用价值〔1〕。1990年证实，64kD蛋白为GAD〔2〕。GAD是合成一种抑制性神经递质的限速酶，在体内催化谷氨酸转化为γ-氨基丁酸。在脑、胰腺等组织均有大量分布〔3〕。为制备GAD抗体测定试剂盒，我们以猪脑制备GAD粗酶，经凝胶层析分离纯化，结合十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)测定分子量、同位素法测定GAD酶活性的鉴定方法，建立了GAD纯化方法，现将结果报道如下。
材料和方法
一、材料
聚丙烯酰胺(丙烯酰胺及甲叉双丙烯酰胺)为德国Fluka公司产品。L-1-14C-谷氨酸为Amerash公司产品。SDS、Sephadex G100、磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate, PLP)、溴化氨乙基异硫脲(aminoethyliso-thiouronium, A[1] [2] 下一页
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