三七总皂苷对氧糖剥夺的皮质神经元损伤的保护作用

【摘要】  　　目的：研究三七总皂苷(PNS)对氧糖剥夺的皮质神经元损伤的保护作用。方法：采用原代培养的大鼠大脑皮层神经细胞，经不同浓度的PNS预处理后，建立氧糖剥夺(OGD)模型，2小时后复氧复糖,模拟再灌注模型。通过MTT比较神经元的存活情况，并测定超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)的活性变化，以及Bcl-2蛋白表达的变化。结果：OGD作用120分钟后细胞活性明显下降，细胞内SOD活性下降，MDA含量升高。PNS 25、50mg/L能明显提高细胞的存活率，SOD活性回升，MDA含量趋向正常，Bcl-2蛋白含量增加。结论：PNS对缺氧缺糖条件下的大鼠皮层神经细胞有保护作用，其保护作用可能与其抑制神经细胞脂质过氧化反应、提高Bcl-2蛋白表达有关。

【关键词】  三七总皂苷 神经元 氧糖剥夺(OGD)

　　材料与方法
   
　　药品与试剂：三七总皂苷(PNS)，血栓通注射液(三七总皂苷含量为35mg/ml)，DMEM/F12培养基，MTT、多聚赖氨酸(poly-D-lysine)、N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(HEP-ES)、NF抗体、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及考马斯亮蓝法蛋白检测试剂盒。
    
　　实验动物：1～3天SD大鼠。
    
　　大鼠大脑皮层神经细胞培养：无菌条件下分离1～3天SD大脑皮层置于含2.5g/L胰蛋白酶的D-Hank’s液中，37℃消化15分，加入含100ml/L牛血清的DMEM/F12培养液中止胰酶的作用，移液管轻轻吹打为单细胞悬液，调整细胞密度为(1～2)×105个/ml，接种于预先经多聚赖氨酸覆盖的96孔板中。接种的第5～7天加入阿糖胞苷(终浓度为10μmol/L)处理24小时以抑制胶质细胞的增殖。
    
　　细胞氧糖剥夺(OGD)模型的建立：参照文献［1～2］方法并改进。培养细胞采用无糖无血清培养液，置于含CO2:N2(5:95)的恒温密闭容器内造成缺氧。细胞缺氧120分种后，换液为无血清培养液中，放至正常CO2培养箱中继续培养24小时。给药组在氧糖剥夺处理前24小时、氧糖剥夺处理过程中及以后，均在培养液中加入不同浓度的PNS。
    
　　MTT检测：细胞活力检测，将皮质神经元以5×106个/孔的密度接种于96孔板上，培养5天后，实验组给予不同浓度的PNS，培养24小时后按上述方法进行氧糖剥夺处理。OGD结束后，将原培养基弃去，加入含MTT(0.5g/L)无血清MEM/F12，常规培养4小时后，每孔加入100μl的DMSO溶解剂，震荡使结晶物充分溶解后，在酶标仪上比色，以不含细胞的培养液为空白组调零，测定波长570nm处的OD值，分析细胞的活性。各组取平均值后按下式计算细胞相对存活率：细胞相对存活率(%)=(实验组OD值/对照组OD值)×100%。
    
　　细胞内SOD和MDA的测定：实验结束后，按文献的方法，参照试剂盒说明，超声裂解细胞后，离心取上清液测定各组SOD和MDA的含量。各样本吸光度值应用可见光-紫外光分光光度计测定。细胞蛋白定量应用考马斯亮兰标准定量方法。
    
　　Bcl-2蛋白表达分析：按文献方法提取蛋白,进行浓度测定,并调整为相同浓度,在12.15%的聚丙酰胺凝胶上电泳45分种后，取下凝胶,切角标记,在4℃恒压14V电转过夜后,取下硝酸纤维膜,用TBS洗2次,用5%脱脂奶封闭2小时,加入一抗于4℃振荡过夜,TBST洗后加入二抗，室温振荡1小时,再用TBST洗膜以除去未结合的二抗,将显色液A、B在用前混合,将NC膜置入摇床,反应1份,暗室曝光,显影,定影后拍照。
    
　　统计学方法：所有描述性数据用mean±S.E.M(X±S)表示，统计学分析应用t检验。
    
　　结  果
    
　　PNS对氧糖剥夺后神

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