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一种新型重组抗体导向溶栓剂的体外溶栓研究 |
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且在人 体内血栓显像中都显示了良好的显像效果［1］，证明了其血栓导向能力 。与尿激酶的化学偶联产物体外溶栓率较单用尿激酶提高了3～5倍［2］。本研究对通过基因工程方法获得的分泌重组SZ51Hu-scuPA抗体导向溶栓剂［3］的阳性细胞克隆进行了体 外扩大培养，应用亲和层析技术纯化SZ51Hu-scuPA融合蛋白，与uPA对125I标记纤维 蛋白原的不同血小板血栓凝块在体外进行了溶栓比较，以期得到一种新型的基因工程抗体导 向溶栓剂。
1 材料与方法
1.1 实验材料 人尿激酶纯品由南京大学制药厂朱长生教授惠赠，比活为155000 U/mg；人纤维蛋白原购自Sigma公司；重组SZ51Hu-scuPA的SP2/0细胞株由本室保存。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞扩大培养 最初接种采用集合多个小方瓶培养的细胞，弃上清 ，以1×105 ml-1细胞密度接种于转瓶(500 ml玻璃转瓶及搅拌动力系统为Bellco公 司产品)， 再次接种时可从生长细胞的转瓶内直接取细胞进行接种。培养基为RPMI1640，补加葡萄糖至 4.5 g/L,置CO2培养箱，37 ℃培养，调节转瓶内转子旋转速度为20 r/min，待细胞停止生长后，继续培养12～24 h，离心收集上清，-70 ℃储存备用。
1.2.2 亲和层析纯化SZ51Hu-scuPA 应用GAH IgG-Sepharose 4B亲和层 析柱纯化SZ51Hu-scuPA重组融合蛋白。SZ51Hu-scuPA融合蛋白中相关IgG和相关scuPA抗原 定量采用ELISA或RIA法，scuPA酶活性单位定量采用纤维蛋白平板法［4］。
1.2.3 鼠源性单抗SZ-51(SZ-51M)和纤维蛋白原的125I标记 采用 Iodogen法［5］标记蛋白。经20%三氯醋酸沉淀法测得标记率为96%～98%。纤维蛋 白原标记125I(125I-Fg)后的可凝蛋白百分比测定，取5 μl 125 I-Fg ，加入0.5 ml人血浆，再加入过量凝血酶，37 ℃放置30 min，离心弃上清，测定凝块的放 射性计数。由凝块的放射性计数/加入125I-Fg总放射性计数×100% 计算得可凝蛋白百分比为96%。
1.2.4 SZ-51Hu-scuPA与SZ-51M的抗体竞争结合试验 于经凝血酶活化 的 血小板中加入等体积0.25%戊二醛，室温下固定1 h，0.3% BSA-PBS重悬，计数血小板 。取5× 107血小板加入125I-SZ51M(5×104 cmp,0.65 μg/ml)和不同浓度(20.8 μg/ml 倍比稀释)的未标记SZ-51Hu-scuPA纯品，阴性对照为SZ-2(抗血小板GPIb单抗)，总体积1 00 μl，37 ℃反应2 h，用0.01 mol/L,pH7.4的PBS缓冲液洗涤两次，测定血小板沉淀物的 放射性计数，计算结合率。
1.2.5 不同浓度血小板血浆凝块的血栓制备 取健康供血者新鲜全血(3.8% 枸橼酸三钠1∶9抗凝)，分离PRP血浆(2.5×105血小板/μl)；PPP血浆(1×104 血小板 /μl) ；再富集PRP血浆(R-PRP：12×105 血小板/μl)。分别向PRP、PPP和R-PRP血 浆中按下 列顺序加入125I-Fg(终浓度500 000 cpm/ml)，CaCl2(终浓度0.05 mol /L)，凝血酶(终浓度1 U/ml)，混匀后立即吸入内径3.5 mm的硅胶管内，37 ℃静置30 mi n，将含有凝块的硅胶管切成1.5 cm长的小段(约含0.12 ml血浆)，取出不同血小板浓度的血 栓凝块(分别称为PPP、PRP、R-PRP血栓)，用0.9% NaCl 3 ml洗涤2次，弃上清后对血栓做 总放射性计数，于每只栓子中加入1 ml PPP血浆。
1.2.6 体外溶栓 取上述制备的含有PRP、PPP和R-PRP3种血栓的血浆， 再分成4组：生理盐水组、尿激酶组、尿激酶与SZ51M等摩尔混合组(uPA+SZ51M)以及SZ51Hu -scuPA融合蛋白组。每组分别加入终浓度10、20和50 U/ml酶活性单位的溶栓剂1 ml， 设3个平行管进行溶栓试验。置37 ℃温箱溶栓1、2、4和24 h，各点分别取出100 μl上 清做放射性计数。溶栓率=血浆中放射性计数/溶栓前栓子的总放射性计数×100% 。
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