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一种改进的cDNA文库固相构建法 |
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王义琴 李文彬 张利明 孙勇如
摘 要：本文介绍一种新的cDNA文库固相构建法。文库构建过程中，cDNA的合成和修饰全部在固相介质——磁珠上完成,简便、迅速、文库质量高，能满足不同目的的cDNA文库构建，是一种值得借鉴和应用的好方法。
关键词：cDNA文库;固相构建;磁珠;天麻抗真菌蛋白
中图分类号：Q785 文献标识码：A 文章编号：0253－9772(2000)04－0253－02
An Improved Method for Solidphase cDNA Library Construction
WANG Yi-qin LI Wen-bin ZHANG Li-ming SUN Yong-ru
（Institute of Genetics,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100101， China）
Abstract：A method for cDNA library construction was introduced.All enzymatic steps of library synthesis were performed on a solid supportmagnetic beads.Therefore it combines fast speed and convenient with high quality library,making it ideally suited for most purposes.It is a good method and worth learning and utilization.
Key words:cDNA library; solidphase construction; magnetic beads; gastrodia antifungal protein
自20世纪70年代中叶首例cDNA克隆问世以来，构建cDNA文库已成为获取目的基因的基本手段之一。但目前来说，cDNA的合成和克隆尚非易事，仍是件费钱、费力的工作。cDNA的固相合成是早为人们熟知的技术［1，2〕，即将oligo(dT)连接在固相介质纤维素、胶粒或琼脂糖上，进行mRNA的分离和cDNA合成。但局限之处是oligo(dT)与纤维素、胶粒或琼脂糖的结合比较牢固，将cDNA洗脱下来时得率不是很高，而且以后的反应步骤也不能都在介质上进行，这可能是该技术应用并不十分广泛的原因。
新近Thomas Roeder提出了一种新的cDNA文库固相合成方法［3］，克服了以前文库构建中存在的缺点，所用的酶和试剂与传统方法完全相同，不同的是cDNA的合成和修饰均在固相支持物——磁珠(magnetic beads)上完成，使建库的工作更为轻松。作者用这种最新的方法并结合现有的条件作了适当的改进，构建了天麻的cDNA文库(见图1)。
1 材 料 和 方 法
1.1 植物材料
9月份采集的新鲜的天麻次生块茎，洗净后放－70℃保存备用。
1.2 所用试剂
链霉亲和素包被的磁珠(strepavidin coated magnetic beads)、cDNA合成试剂盒购自Promega公司；NotI酶购自MBI公司,λ噬菌体载体λE(cell购自Amersham Pharmacia公司；体外包装试剂盒购自Promega公司；生物素化oligo(dT)15由上海生工生物工程公司合成。
1.3 天麻总RNA的提取
参考Shujun Chang的CTAB法［4］，并做适当改进。取约2g冻存的天麻次生块茎，在液N中研磨成粉末，然后按1：2(v/v)加入预热到65℃的提取缓冲液(2％ CTAB,2％ PVP,100mmol/L Tris－HCl，pH8.0,25mmol/L EDTA,2.0mol/L NaCl,0.5mol/L Spermidine,混合后高压灭菌，使用前加入2％β－羟基乙醇)，充分提取后，离心；等体积的氯仿提取上清两次，取上清加入1/4体积的10mol/L LiCl，混匀，4℃特异性沉淀出RNA，经乙醇沉淀和清洗，重悬于适量DEPC处理的水中。琼脂糖凝胶电泳检测后，放入－70℃保存备用。
1.4 天麻c[1] [2] 下一页
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