|
一种改进的cDNA文库固相构建法 |
| |
DNA文库的固相法构建
参照已发表的方法［3］，并做适当改进，使之更简便可行。采取磁珠法从总RNA分离mRNA，生物素化的oligo(dT)15，在oligo(dT)15 和生物素之间加了NotI的酶切位点，即5′－biotinGAG AGA GAG AGA GCG GCC GCT TTT TTT TTT TTT TT－ 3′ 。mRNA被磁珠捕获后，用cDNA第一链合成缓冲液冲洗mRNA－磁珠复合物两次，直接进行cDNA的合成。cDNA的合成中所需的酶、缓冲液和反应时间均同cDNA合成试剂盒的说明。反应过程中，将反应的小管放到摇床上，不断摇动，保持磁珠始终处于悬浮状态；每次反应前，用该反应的缓冲液冲洗磁珠和核酸复合物，以保证反应的酶在最适条件下发挥作用。(1)5′－Biotin－oligo(dT)15－引物与mRNA退火后，将总RNA与磁珠混合，生物素化引物连接在链霉亲和素包被的磁珠(Streptavidin coated magnetic beads)上，通过磁性吸附，可一步分离磁珠——mRNA复合物；(2)以oligo(dT)15(或随机片段为引物)合成第一链cDNA；(3)cDNA第二链的合成；(4)T4－DNA聚合酶酶切平端；(5)连上EcoRI接头并磷酸化；(6)用NotI酶将cDNA从磁珠上释放下来，与载体连接。
合成的双链cDNA经过切平端，连上EcoRI接头和磷酸化，合成和修饰而完成。加入NotI酶，37℃反应1.5h，将修饰好的cDNA从磁珠上切下来，最后吸住磁珠，取出上清，测定上清在260nm的紫外吸收值，大体估计cDNA的产量。按cDNA合成试剂盒说明，沉淀出cDNA，溶解于10μl TE缓冲液。这样，cDNA一端是EcoRI酶切位点，一端是NotI酶切位点。可直接与λExcell的两个臂相连，插入片段与载体的比例为1.2∶1，加入连接酶，4℃连接过夜。经体外包装后，生成完整的cDNA文库，与载体相连和体外包装均按试剂盒说明进行。cDNA第一链和第二链合成过程中，做小规模α－32P－dCTP标记的示踪反应，以检测cDNA合成的质量［5］。
图1 cDNA文库固相构建法简介
□EcoRI位点，●磁珠，■NotI位点
Fig.1 The introduetion of the solid-phase cDNA library construction
2 结 果 与 讨 论
2.1 天麻总RNA的提取
天麻的次生块茎含有较高的多糖，一般的异硫氰酸胍法不适用。CTAB法则适用于含多糖的材料，不但简单方便，而且提取出来的总RNA完整性好、质量高，A260/A280=2.00，A260/A230=2.19。
2.2 cDNA文库的固相合成
从cDNA合成的示踪反应看，cDNA的分布比较均匀，从0.3～7kb均有条带分布，可见cDNA的合成质量还是较高的。经计算文库的滴度是3.1×105pfu/ml,包装效率为6×106重组体/μgDNA。我们从该文库中筛选到了编码天麻抗真菌蛋白GAFP的基因［6］。
2.3 cDNA固相构建法的优点
固相构建法与传统的方法相比主要有两点改进之处，第一是利用生物磁珠法这种简便、快速、高效的分子生物学分离技术，同时结合生物素－链霉亲和素系统的特异亲和力，大大提高了分离效率［3，7］。每步反应中不需用化学试剂沉淀cDNA，减少了cDNA的损失。由于生物素和链霉亲和素的结合几乎是不可逆的，在用溶液冲洗磁珠——cDNA混合物的过程中，也不会有cDNA的损失，并且能够保证各步反应中酶的反应条件最适；第二点是在oligo(dT)与生物素之间加了一个NotI的酶切位点，使修饰好的cDNA从磁珠上的分离变得十分方便。切下来的cDNA双链可直接与载体相连，顺利地解决了生物素与链霉亲和素不可逆结合的问题。
上一页 [1] [2]
上一个医学论文： 现代人类的起源和迁移 来自母性遗传的证据
下一个医学论文： 一种提高RAPD技术扩增效率的有效方法
|
|
|
|
|
|
|
您现在的位置： 绿色健康网 >> 医学论文 >> 基础医学论文 >> 正文