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一种提高RAPD技术扩增效率的有效方法 |
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傅俊江 李麓芸 徐湘 王智 唐果 尹长民 卢光
摘 要：RAPD技术是由Williams等于1990年首先创立的一种DNA分子标记技术。但是由于低的退火温度和短的引物序列等原因，常常使得RAPD技术的分辨率和可重复性低。本文介绍一种通过延长从退火到延伸的ramp时间，提高RAPD产物的分辨率和产量，由此提高RAPD技术的扩增效率的有效方法。
关键词：RAPD；蜘蛛；ramp；效率； 指纹
中图分类号：Q751 文献标识码：A 文章编号：0253－9772(2000)04－0251－02
An Improved Method for Increasing the Efficiency of the Technique
of Random Amplified Polymorphic DNA(RAPD)
FU Jun-jiang LI Lu-yun LU Guang-xiu
（Human Reproductive Engineering Laboratory,Hunan Medical University,Changsha 410078,China）
XU Xiang WANG Zhi TANG Guo YIN Chang-min
（Department of Zoology of Life Science College,Hunan Normal University,Changsha 410081,China）
Abstract:The random amplified polymorphic DNA(RAPD)is a technique of DNA molecular marker,which was first established by Williams in 1990.The resolution and repetition is low because of the low annealed tempture and short primers in the RAPD.In this paper we introduce an improved method for increasing the efficiency of the technique of RAPD by prolonging the ramp time from annealing to extension and increasing the resolution and production.
Key words:RAPD;spidle;ramp;efficiency;finger printing
RAPD技术是由Williams等［1］于1990年首先创立的一种DNA分子标记技术。它是利用单一的10个碱基的寡核苷酸作为引物，对基因组DNA进行PCR扩增，这些扩增产物DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性。它一产生便得到了广泛的注意，并在动物、植物、人和微生物的遗传多样性检测、基因定位、品系（克隆）鉴定、医学鉴定、系统演化、遗传图谱的构建等方面得到了广泛应用［2,3］。但是由于低的退火温度（36℃）和短的引物序列（10碱基）等原因，常常使得RAPD技术的分辨率和可重复性低。本文介绍一种通过延长从退火到延伸的ramp时间，提高RAPD产物的分辨率和产量，由此提高RAPD技术的扩增效率的有效方法。
1 材 料 和 方 法
1．1 DNA提取
蜘蛛肢体或小鼠组织用70％的酒精搽洗干净，取1～2克放入含有1 ml的1×核裂解缓冲液的匀浆器中，匀浆后，倒入10ml离心管中，再用2ml 1×核裂解缓冲液冲洗匀浆器后也倒入，然后在离心管中加入300μl SDS（10％）和10μl 蛋白酶K（20mg/ml），55℃消化5小时或37℃消化过夜，应用常规酚/氯仿抽提法提取DNA［4］。
1．2 PCR扩增
10μl反应体系中包含如下成分：蜘蛛模板DNA 06μl约20ng，25mmol;L dNTP 1μl,25mmol/L Mg＋＋ 08μl,10×缓冲液1μl，10μmol/L引物02μl(S60序列为：ACCCGGTCAC)，Taq DNA聚合酶015μl（4U/μl）[1] [2] 下一页
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