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一种提高RAPD技术扩增效率的有效方法 |
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（均购自上海生工公司）。在GenAmp9600(PE9 600，美国PE公司产)PCR扩增仪上完成PCR扩增， 具体条件如下：95℃预变性1分钟30秒后，94℃ 40秒，36℃ 1分30秒，72℃ 1分30秒，共完成40个循环，72℃ 延伸5分钟，最后置4℃ 保温。其中从退火到延伸的ramp时间分别为0分钟(标准的最大加热率为1℃/秒)、3分钟（即02℃/秒）、5分钟（即013℃/秒）、7分钟（即0086℃/秒）和9分钟（即0067℃/秒）。
1．3 电泳检测
每管中加入6×加样缓冲液 2μl，混匀后点样于2％ 的琼脂糖凝胶（05μg/ml EB）,100V电泳40分钟，紫外透射仪观察结果并照相。
图1 DNA模板在不同ramp时间下的指纹图
M.示λDNA用EcoRI/HindIII双酶切的DNA分子量大小椟记;1-5.示ramp时间分别为1、3、5、7、9分钟的DNAS指纹图（注意不同ramp时间的DNA指纹条带的数目多烽和亮度均不同）。
Fig.1 The fingeer printiong of DNA templete at teh different ramp time M:indicate DNA molecular siaze marker cut the DNA with EcoRI/Hind III ;Lane 1～5,indicate the λDNA figer printiong at ramp time 1,3,5,7,9 respectively (pay attention to teh number and brightness of DNA fingerprinting at the different ramp time )
2 结 果 与 讨 论
各个从退火到延伸的ramp时间的PCR结果见图1，从图中可以看出，随着ramp时间的延长（0、3、5、7、9分钟），PCR产物的量（主要是大片段DNA）和DNA条带数（特别是在3分钟）也相应增加。从而提高了RAPD技术的分辨率、产量和可重复性。但是并不是ramp时间愈长效果愈好。从我们的结果可以看出，ramp时间为3分钟，也就是说以02℃/秒的速度上升，其DNA产量和条带数最多，而再延长其时间，虽然大片段DNA的产量提高了，但小片段DNA的产量并未提高。这可能是延长了ramp时间，小片段的优先扩增受到抑制，而大片段反而优先扩增了。这是由于引物和dNTP等的浓度有限，从而使小片段扩增受到了影响。
影响RAPD技术的分辨率和可重复性低的因素有许多，如模板质量和浓度、短的引物序列、PCR循环的次数、基因组DNA的复杂性、技术设备、以及其它一些因素等，都可影响RAPD技术在基因组成分并不十分清楚的各种动植物中的遗传多样性研究。
我们在应用RAPD技术研究蜘蛛的系统演化和小鼠DNA的指纹分析中发现，在其它条件不变的情况下，如果适当延长从退火到延伸的ramp时间，则既可提高RAPD产物的产量，也可增加DNA条带数（这里主要是指在3分钟时）。因此，它对于提高RAPD技术的可重复性和分辨率均有一定的帮助。它对于那些难扩增甚至不能扩增的引物使用该法也有可能扩增出特异性的DNA条带。可能的原因是，由于适当延长了从退火到延伸的ramp时间，有利于引物和模板DNA的结合，同时低的加热速度又有利于增加引物与模板DNA复合物结合的稳定性，避免引物从模板上掉下来，从而增加了PCR产物的产量和条带数。
作者简介：傅俊江(1966－)，男，湖南娄底人，助理研究员，医学遗传学博士。
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