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去肾上腺大鼠垂体内IL |
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节值得进一步研究。
IL-6在垂体前叶中的含量甚微，一般形态定量法揭示其确切变化有一定的难度。我们在形态学定位的基础上结合微量PCR法定量分析，对去肾上腺大鼠垂体前叶中IL-6表达进行动态观察，得到了满意的结果。
材料和方法
1. 动物分组及手术
成年SD雄性大鼠30只，体重200～250g，1笼养5只，自由进食，每日昼夜光照为12h/12h。在安静环境中饲养1周，随机分为正常对照1组和双侧肾上腺切除5组。后者用戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉(40mg/kg)，在无菌条件下从肋脊角处摘除双侧肾上腺，术后给予生理盐水饲饮。
2. 取材
正常对照组及手术组术后1、2、3、4和5d动物在戊巴比妥钠腹腔麻醉下开胸，留取血清样品作免疫PCR测定用。然后经左心室插管至升主动脉。灌流100ml无菌生理盐水以洗净血液，取垂体前叶迅速冷冻保存，留作PCR及原位杂交用。原位杂交标本用恒冷箱切片机作冰冻连续切片，厚15μm。
3. 原位杂交法分析
根据Northemann发表的大鼠IL-6 cDNA全序列［4］，于3′端截取42bp长度的片段，并合成寡核苷酸作为探针。探针标记和检测按地高辛DNA标记与检测试剂盒(德国Boehringer Mannheim Biochemica)说明书操作。杂交的主要步骤：取出垂体切片，无酶状态下空气晾干约1h，浸入4%多聚甲醛固定20min，依次经浸洗、蛋白酶K(50mg/L)消化、4%多聚甲醛再固定、0.25%乙酸酐封闭等10余步处理后，入杂交液(探针浓度为0.1mg/L)于42℃湿盒中孵育16h，其后分别经浓度递减的系列标准枸橼酸盐溶液(SSC)漂洗，再入地高辛抗体工作液(1∶5 000)室温作用0.5h，洗涤后加入新鲜配置显色液于室温下暗处显色。镜下观察至显色适度时，浸入蒸馏水中以终止反应。最后经系列乙醇脱水、二甲苯透明、封片。
4. PCR定量分析
4.1 微量免疫PCR(I-PCR)法)
4.1.1 样品提取液制备：正常对照组及肾上腺切除术后4d手术组各5只，取垂体前叶置100μl的1%Triton X-100 0.05mol/L PBS(pH7.4)中，匀浆后以10kHz 5s×3超声破碎(Soniprep SANYO),离心(10000r/min)×10min，取上清紫外分光光度法定量，稀释提取液使蛋白浓度达到1g/L。
4.1.2 免疫PCR操作步骤：按徐平西等［5］建立的简易免疫PCR法，将上述提取液和1 000倍稀释后的血清20μl用戊二醛直接包被在洁净0.5毫升规格的聚乙烯PCR管内壁，空白对照管以1% BSA替代；以洗涤液(1%吐温20-PBS)洗涤3次，每次3min，依次加入1∶5 000稀释度的兔抗IL-6多克隆抗体20μl(由北京军事医学科学院沈倍奋教授惠赠)，室温下孵育3h,洗涤同上；加入1∶500稀释度的生物素化羊抗兔抗体20μl(Sigma公司)，洗涤液洗涤；加入1∶500稀释度的生物素化羊抗兔抗体20μl(Sigma公司)，室温下2h，洗涤液洗涤；加入链霉卵白素-报道模板DNA复合体20μl，置室温1h，洗涤液充分洗涤，最后以无离子水洗涤2次，拍尽残液。每管加入20μl标准PCR反应液，覆盖以矿物油，盖紧小管入PCR仪。聚合反应的温度参数为起始变性(94℃×2min)；20个PCR循环：变性(94℃×30s)，退火(56℃×40s)，延长(70℃×40s)；后置延长(72℃×5min)。取管内PCR产物5μl,行2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色。紫外光下摄片，扫描灰度，分析结果。
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