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用BrdU标记技术观察大鼠脊髓上胸段灰质细胞的分化发育 |
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ly a few of BrdU immunoreactive neurons appeared in posterior horn. Conclusions BrdU label technique might be a good method for symbolizing cells of spinal gray matter,the appropriate time of BrdU symbol was at E12d,the perfect time of embryonic spinal graft symbolized by BrdU was at E13d.
【Key words】 5-bromo-2-deoxyuridine; Spinal cord; Development; Graft; Rat
有关脊髓损伤后神经再生和功能修复的研究已有近百年的历史，但由于神经元轴突再生能力极其有限［1］，人们试图通过胚胎神经组织的脊髓内移植，达到脊髓损伤后的神经再生和功能修复的目的［2］。胚胎脊髓是一种低分化神经组织，在被移植后可继续生长分化，并向宿主脊髓投送新生的神经纤维［3］，近年来，人们已开始用富含运动神经元的脊髓腹侧组织植入被特异性损毁运动神经元的大鼠脊髓内，但对供体神经组织取材的最佳时间尚不统一［4～6］，由于发育分化后的胎鼠脊髓组织与成体脊髓非常相似，难以辨别，所以人们开始考虑引入神经标记技术［4］。本实验用5-溴-2-脱氧尿嘧啶(5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU)标记DNA，并用抗BrdU单克隆抗体进行ABC免疫细胞化学染色，观察大鼠脊髓灰质细胞的增殖分化情况，以期了解脊髓灰质细胞分化完成的确切时间，寻找供体组织取材的适合时间，为下一步进行脊髓移植提供实验资料。
材料和方法
1. 实验动物
实验用健康雄性SD大鼠18只，以上午8∶00阴栓出现确定受孕时间。孕鼠分别于受孕后E10、E11、E12、E13和E14d共5个时间，于母体腹腔注射BrdU(Sigma B5002)25g/2L生理盐水，每隔2.5h注射1次，共6次，BrdU总量150mg/只。每个时间点3～4只大鼠。
2. ABC免疫细胞化学染色
于E17d，深麻醉下取胎鼠放入4%多聚甲醛(4℃)，固定8d。在手术显微镜下取胎鼠上胸段脊髓，入10%蔗糖磷酸缓冲液2h，再入30%蔗糖磷酸缓冲液至沉底。恒冷箱切片机(-20℃)切片，片厚20μm，所有切片均为脊髓横切面。用抗BrdU单克隆抗体(Sigma,B-2531)进行ABC免疫细胞化学染色；简要过程如下：(1)4N HCl，室温，10min；(2)0.3% H\-2O\-2，室温，5min；(3)正常羊血清，室温，1h(不冲洗)；(4)1∶1 500兔抗BrdU单克隆抗体，4℃，湿盒，24h；(5)1∶200生物素化羊抗兔IgG抗体，4℃，湿盒，4h;(6)1∶100 ABC复合物，4℃，湿盒，4h；(7)用葡萄糖氧化酶-二氨基联苯胺-硫酸镍铵(GDN)法呈色5min；以上各步骤前后均用0.01mol/L PBS(pH7.35)漂洗3×10min；常规脱水、透明、封片。染色结果用Olympus BH-2显微镜观察并摄片。本实验用0.01mol/L PBS或正常羊血清替代第一抗体作为阴性对照。
结果
孕鼠于E10d腹腔注射BrdU，于胎鼠E17d时，脊髓上胸段BrdU免疫反应神经元主要集中在脊髓后角，脊髓侧角BrdU免疫反应神经元较少，前角仅有少量的BrdU免疫反应神经元(图1)；孕鼠于E11d腹腔注射BrdU，于胎鼠E17d时，脊髓上胸段后角BrdU免疫反应神经元较E10d减少，侧角和前角BrdU免疫反应神经元较E10d增多(图2)；孕鼠于E12d腹腔注射BrdU，于胎鼠E17d时，脊髓上胸段BrdU免疫反应神经元主要集中于前角和侧角，而后角仅有少量的BrdU免疫反应神经元(图3)；孕鼠于E13、E14d腹腔注射BrdU，于胎鼠E17d时，脊髓上胸段未见BrdU免疫反应神经元出现。各例鼠胎脊髓的部分相邻切片以磷酸缓冲液替代抗BrdU第一抗体后未见BrdU免疫反应神经元(图4)。各实验组BrdU标记结果稳定，形态学变化基本一致。
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