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尿液中 |
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仪器 由自动部分收集器(上海沪西生化仪器厂产，BSZ-160型)、核酸蛋白检测仪(浙江永嘉电器厂)及海尔冷藏陈列柜等组装的层析系统。日立高速冷冻离心机(20PR-520)。日立7150型生化分析仪。DYY-Ⅱ型稳压稳流电泳仪和DYY-Ⅱ型琼脂糖水平电泳槽(北京六一仪器厂)。Beckman700分析系统。Mini-PROTEAN型垂直板型电泳仪(BIO-RAD公司)。透析浓缩装置(本室组装)。
1.2 试剂 丙烯酰胺(Sigma),甲叉双丙烯酰胺(Aldrich),四甲基乙二胺(TEMED,Sigma),十二烷基硫酸钠(SDS,Serva),DEAE-Sephacel(Pharmacia),CM-葡聚糖凝胶C-50(Pharmacia),葡聚糖凝胶G-75(Pharmacia),2-氨基-二甲基-1,3丙二醇(Fluka),琼脂糖(Serva),4,6-亚乙基-4-硝基酚-α-庚糖和α-葡萄糖苷酶(BM公司),Tris、过硫酸铵、硫酸铵、总蛋白标准液、顺丁烯二酸、可溶性淀粉、甘氨酸、巴比妥、巴比妥钠、磷酸盐、醋酸盐、氯化钠及氯化钙等(均为国产)。
1.3 原材料 正常人的新鲜尿液约50 kg。
1.4 方法
1.4.1 提纯方法 参考Gubem G等［1］的方法加以改进，步骤如下：
收集正常人新鲜尿液约50 kg，3号砂芯漏斗减压过滤后，用透析浓缩装置将其浓缩。共得浓缩尿2170 ml，pH接近7.0。用40%饱和度(NH4)2SO4沉淀后(室温、4小时)，4℃、6000×g离心25分钟，去上清。用约200 ml含1 mmol/L CaCl2的Tris-HCl缓冲液(10 mmol/L，pH 8.8)溶解沉淀物，4℃、10 000×g离心20分钟。取上清，用上述Tris-HCl缓冲液透析此上清液至透析液不含SO2-4为止。共得透析液84 ml，置4℃冰箱中保存。
在0.8×20 cm的DEAE-Sephacel柱中,用不含NaCl的Tris-HCl缓冲液平衡后上样,用含0～0.5 mol/L NaCl的Tris-HCl缓冲液梯度洗脱。收集酶活力1000 U/L以上的部分,合并后用含NaCl 10 mmol/L、CaCl2 1 mmol/L、pH 4.2、10 mmol/L的醋酸盐缓冲液透析至pH下降到4.2左右。在2 cm×40 cm的CM-Sephadex C-50柱中,用醋酸盐缓冲液平衡后上样,用含NaCl 0～0.4 mol/L的醋酸盐缓冲液洗脱,收集淀粉酶活力1000 U/L以上的部分,浓缩后用pH 7.1、40 mmol/L的Na2HPO4-KH2PO4缓冲液透析一天。上样于用该磷酸盐缓冲液平衡的1.6 cm×100 cm的Sephadex G-75层析柱，用同一缓冲液洗脱。收集洗脱液，合并淀粉酶活力曲线峰值部分，共66 ml，置－20℃冰箱中保存。纯化后的淀粉酶比活达到84.3 kU/g蛋白。
1.4.2 鉴定方法 提纯的淀粉酶在日立7150型自动生化分析仪上作其它各种酶的检测(上海长征公司Trace试剂盒)。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)证实各步分离提纯的效果。琼脂糖凝胶电泳法分离淀粉酶同工酶，电泳结束后，碘-淀粉法行同工酶染色。
1.4.3 分析方法 实验过程中多数情况下采用碘-淀粉比色法［5］测定淀粉酶的活力，而分步提纯的各阶段产物的活力则在7150型生化分析仪上进行测定(上海长征公司Amy试剂盒)。蛋白质浓度测定用Lowry法［9］。α-淀粉酶米氏常数(Km)的测定用连续监测法。实验方法如下：用pH 7.1的PIPES缓冲液［11］配制各种浓度的EPS(0.05～2.0 mmol/L)，取EPS 250 μl与过Sephadex G-75后的样品6 μl混合，再加入多功能的α-葡萄糖苷酶(8 kU/L)50 μl，混合后用Beckman700分析系统于37℃测定其吸光度的变化。延迟时间120 s，读数时间90 s，波长405 nm，常数(F)为4820［11］。用Lineweaver-Burk双倒数作图法计算Km值。
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