考马斯亮蓝显色法测定精浆蛋白水解酶

徐晓凤　黄宇烽

摘要　用酪蛋白作底物，考马斯亮蓝显色，建立了精浆蛋白水解酶的测定方法。本法以0.05 mmol/L pH 7.6Tris-HCl作缓冲液，底物浓度为1 mg/ml，线性范围在535～4 280 U/L，批内CV为2.6%，批间CV3.3%。健康人精浆蛋白水解酶活力为1 420～2 870 U/L，不育患者(精液液化正常，n＝40)精浆蛋白水解酶活力为1 326～2 628 U/L，液化异常或粘稠度增高的不育患者精浆蛋白水解酶活力为540～852 U/L，提示精液液化异常或粘稠度增高的不育者，精浆蛋白水解酶活力显著降低。
关键词　蛋白水解酶；精浆；不育症

　　多年的研究表明，精液中存在凝固及液化因子，其中前者主要来源于精囊，后者主要来源于前列腺，目前已发现多种参与或影响精液液化的因子，其中以蛋白酶系统最重要，其在精液液化过程中可能起到蛋白水解作用。Manala等［1］最近的研究证实了这一点。为此，本文［2］建立了一种精浆蛋白水解酶的测定方法，并就临床意义作了探讨，现将结果报告如下。

1　原理
　　在一定条件下,底物酪蛋白被精浆蛋白水解酶水解后,不再与考马斯亮蓝G250形成蓝色络合物,未被水解的酪蛋白量,与精浆蛋白水解酶呈反比,测定其含量推算出精浆蛋白水解酶的活力。

2　材料与方法
2.1　材料　考马斯亮蓝G250(Fluka)，胰蛋白酶(Sigma)，经标定活力为10 700 U/mg，0.05 mol/L pH 7.6 Tris-HCl缓冲液。
2.2　标本来源　正常男性精浆40份，不育男性精浆40份，其中液化正常者20份，液化异常或粘稠度增高的20份。
2.3　胰蛋白酶标准液　称取胰蛋白酶5 mg加1000 ml生理盐水使成浓度为5 mg/L，相当于胰蛋白酶为53 500 U/L。并用生理盐水稀释成(U/L)535、1 070、1 750、2 675、5 350五种不同的浓度。
2.4　考马斯亮蓝溶液　100 mg考马斯亮蓝G250溶于50 ml 95%乙醇中，加入100 ml85%磷酸，最后用蒸馏水稀释至1 000 ml。
2.5　酪蛋白溶液　取100 mg酪蛋白加0.05 mol/L，pH 7.6 Tris-HCl缓冲液100 ml，使成浓度为1 mg/ml。
2.6　标准曲线制备　取华氏试管5支，各加入250 μl酪蛋白溶液，37℃预热10分钟，于5管中分别加入五种不同浓度的胰蛋白酶标准液各10 μl，于37℃反应直接加入5 ml考马斯亮蓝溶液，在721分光光度计上测定595 nm的吸光度，以不加酶液的同样反应液为对照，以不加酶液和不加酪蛋白的同样反应液为空白，纵座标为A595nm减少值，横座标为胰酶含量制备标准曲线。
2.7　精浆蛋白水解酶测定　取精浆样品10 μl，加入250 μl酪蛋白溶液，37℃反应30分钟，加入5 ml考马斯亮蓝溶液，混匀读取吸光度。测定时同时设对照管和空白管。对照管用250 μl酪蛋白与5 ml考马斯亮蓝加10 μl精浆，空白管用260 μl生理盐水加5 ml考马斯亮蓝。以空白管调零，测定对照管和测定管的A595nm的差值，查标准曲线得出精浆水解蛋白酶活力。

3　实验与结果
3.1　底物浓度选择　用0.05 mol/L，pH 7.6 Tris-HCl缓冲液配制酪蛋白浓度为0.1～2.0 mg/ml的溶液，测定不同值样品，在本实验条件下，当底物浓度在0.5 mg/ml时，反应已达平衡，为此我们选用底物浓度为1 mg/ml。
3.2　最适pH选择　用0.05 mol/L，pH 6.8～8.0 Tris-HCl缓冲液配制酪蛋白底物液，在其它条件不变的情况下，测定样品中精浆蛋白水解酶活力，观察pH对酶促反应速率的影响。结果显示，在pH 7.4～7.8范围内酶活性最高，为此本实验选用缓冲液的pH为7.6。
3.3　反应时间的选择　取10 μl混合精浆样品，加入250 μl酪蛋白溶液，分别在37℃，10、20、30、40、50、60(min)加入5 ml考马斯亮蓝，混匀，按本法测定结果。结果表明，酪蛋白水解反应在30 min内基本成线性，30～60 min反应进程缓慢，故我们选取30 min 加入考马斯亮蓝。见图1。

图1　反应进程曲线

3.4　重复性试验　批内CV：取1份精浆标本，精浆水解蛋白酶活力为2 156 U/L，批内测定20次

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