绿色荧光蛋白标记铜绿假单胞菌生物膜形成的动态观察及结构定量分

    2.4  ISA软件结构定量化分析

    对各时间组模型的平均厚度、AP、ADD及TE进行统计，随着培养时间延长，各时间组PAO1菌株BF的平均厚度不断增加，增加程度在前3d比较明显，每个时间组之间增加10μm以上，3d后增加速度减慢，3d组与6d组BF的平均厚度仅增加了6μm(表1)；随着培养时间延长，各时间组模型的AP值呈下降趋势，由最初的0.98下降到0.92；TE值由最初的0.7上升到4.3，增幅接近6倍；ADD值虽然变化幅度不大，但是呈上升趋势(表1)。表1      各时间组PAO1菌株BF的平均厚度、AP、 ADD及TE值

    3  讨论
    细菌BF是一个三维立体空间结构的生态系，是一个具有高度结构性、协调性和功能性的组织群体，BF结构的维持对BF生物学行为具有重要意义。深入认识BF的结构特点，不能停留在某一平面的形态描述，还需要对BF的空间结构展开定量化分析。由于报道基因中常用的绿色荧光蛋白(GFP)的基因具有基因小、性质稳定、对细胞安全等优点，本实验运用电转化方法，成功地将pGFPuv转入PAO1中，建立体外PAO1菌株BF模型，运用CLSM观察以保证细菌BF结构的完整性，连续检测其在玻片表面定植形成BF的过程，结合计算机图像处理分析系统，对BF结构进行定量化分析。

    BF形成发展是一个动态过程，生长周期一般分为5个阶段：最初的定植阶段、不可逆黏附阶段、结构分化阶段、发展成熟阶段和解聚再定植阶段［4］。本实验通过CLSM连续动态观察PAO1菌株BF形成，基本反映了这样一个过程：6h左右PAO1菌株开始在玻片表面黏附聚集，1d左右初步形成BF，3d时BF基本形成，具备三维结构，此后BF逐渐发展达到一个平衡，这与文献报道基本一致［5］。随着培养时间延长，BF厚度逐渐增加，但趋势渐缓，可能与BF营养渗透屏障有关。

    本实验还采用ISA软件获得了BF空间结构参数的定量化数据，实现了对BF基础结构特征的定量化分析。该软件由美国Montana州立大学的生物膜工程中心2000年开发，采用自动定阈系统［6］，降低了图片处理中主观因素的影响，对BF的二维和三维结构进行更多参数的测定和比较。

    ISA提供厚度参数显示，GFP标记的BF模型平均厚度在前3d内增长速度明显快于后3d，提示BF生长速度的不均一性。细菌黏附后初期，BF迅速增厚，但随着时间延长，BF厚度增加趋势减慢，其原因除与营养限制有关外，也可能是BF增加到一定厚度后，为保证底层细菌获得一定的营养物质而维持自身结构，对自身发出密度感应(quorum sensing，QS)信号产生反应，达到平衡状态。

本实验对BF的观察中还发现BF并非一层单纯的致密膜，其内部存在很多黑色相互交通的间隙及孔道，Stoodley等［7］认为这些大、小不一的间隙和通道是BF结构的重要组成部分，其中充满了胞外多糖和蛋白质等营养物质，与深层BF中的细菌生长关系密切。Wood等［8］在牙菌斑BF也发现类似的间隙和通道贯穿于整个BF之中，其功能类似初级循环系统，活菌紧紧围绕在这些孔和通道的周围，保证营养的获取和排除代谢废物。此外，BF还可以借这些通道来感知QS信号。BF这种结构特点决定BF具有一个能适应多种理化变化的内环境。

    ISA软件通过区域孔率(AP)和平均扩散距离(ADD)这两个参数，客观反映BF结构发展过程中间隙孔道及营养物质供应距离变化。本实验发现随着培养时间延长，BF厚度逐渐增加，AP逐渐减低，ADD逐渐增加，提示BF逐渐发展，细菌聚集越来越致密，BF结构中间隙及通道的孔径和数目减少，相应营养物质的供应距离增加，细菌物质代谢受到一定限制而将逐渐发展达到一个相对稳态。

    BF不仅在结构上存在多样、开放、不均一性特点，而且环境中营养物质、代谢产物、信号分子等物质在BF各个层面也呈现不均一性，使得各层BF菌生理活性及耐药水平也表现出不均一性，最终控制了

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