successfully by CLSM after genetically tagged with GFP. ②The quantitative data from ISA software showed that the thickness of biofilm accumulated during biofilm growth, the rate was more obvious during the first 3 days than the last 3 days (19.6μm vs. 6.1μm); meanwhile the areal porosity (AP) decreased from 0.98±0.01 at 6h to 0.92±0.02 at 6d, the average diffusion distance (ADD) increased slightly from 1.00±0.009 at 6h to 1.06±0.027 at 6d; the textural entropy (TE) increased from 0.7±0.08 at 6h to 4.3±0.09 at 6d. Conclusions The ISA software could provide useful information of bacterial biofilm spatial structure in PAO1 biofilm process. Quantifying bacterial biofilm structure permitsed correlating biofilm development with biofilm performance.
KEY WORDS Biofilm; Pseudomonas aeruginosa; Quantitative analysis; Structure 长久以来，人们对细菌的认识停留在浮游态水平上，但自然界中99%的细菌以生物膜(biofilm，BF)的形式存在。细菌BF是细菌为适应生存环境黏附惰性或活性材料表面形成的一种与浮游细胞相对应的生长方式，具有环境适应能力更强，抵抗吞噬细胞作用，逃避宿主免疫，尤其耐药性极强等生物学特性，而BF的许多特性均与其特殊形态结构有关。铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，Pa)是我国医院和社区获得性感染及重症监护病房感染的重要条件致病菌，近年来研究证明，该菌极易形成BF［1］，临床上，有BF表型的Pa往往引起难以治愈的严重感染。以往研究多采用光镜、扫描或透射电镜等观察细菌BF结构，但样本在脱水、固定、染色等处理过程中易发生结构扭曲及关系改变。本实验通过建立体外PaO1菌株BF模型，结合绿色荧光蛋白(GFP)标记技术，运用激光共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscopy，CLSM)摄取BF发展成熟各阶段不同层面的图像，所获图片堆经图象结构分析(image structure analyer，ISA)软件分析，获得PAO1菌株BF发展过程相关空间结构变化的数据，以期实现对细菌BF的无损伤观察，并对BF空间结构的定量化分析进行了初步探索。
1 材料和方法
1.1 试剂和菌株
铜绿假单胞菌PAO1菌株(本实验室保存)，pGFPuv质粒(Clontech公司)，质粒DNA小量提取试剂盒(日本BioFlux公司)，限制型内切酶EcoRI和HindIII(宝生物公司)，ISA软件(美国Montana州立大学Haluk Beyenal教授提供)。
(1)PAO1菌株电感受态制备 参考单志英等［2］实验方法，将过夜增菌的PAO1菌株转接于50ml SOB培养基中，37℃，200r/min振荡培养；A600值为0.7左右时中止培养；2℃，6000r/min离心15min；菌体沉淀依次用等体积、1/2体积、1/5体积的0.3mol/L冰浴蔗糖溶液重新悬浮，洗涤菌体；2℃，6000r/min离心15min，最后根据菌体多少加入不同体积的0.3mol/L蔗糖溶液将菌体混匀；分装成每管100μl，直接用于电转化。
(2)pGFPuv
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