质粒转化和转化菌株筛选 感受态细胞100μl，质粒约50ng，加入预冷的0.1cm电转化杯中；在BioRad电转化仪上(设置电压1.5kv，电容25μF，电阻200Ω)进行电击5ms；将转化体系加入37℃温浴的800μl SOC培养基中，37℃，100r/min振荡复苏1h；取100μl菌液涂布筛选培养基，37℃，16h～18h；在筛选培养基上生长，且紫外灯下有绿色荧光的菌落即为实验需要的转化菌株。
(3)转化菌株中质粒提取和酶切电泳鉴定 挑取表达强绿色荧光的转化菌株单菌落，接种LBroth培养液，37℃振荡培养过夜；按照BioFlux公司质粒提取试剂盒产品说明进行质粒的小量提取；0.8%琼脂糖凝胶电泳；对照pGFPuv质粒图谱进行鉴定。用EcoRI和HindIII行双酶切，反应温度为37℃；反应体系为HindIII 1μl，EcoRI 1μl，10×M缓冲液2μl，提取质粒17μl，作用12h；0.8%琼脂糖凝胶电泳。 dedecms.com
(4)pGFPuv转化菌株建立BF模型 挑取GFP转化PAO1菌株单菌落接种LBroth培养液，37℃，180r/min振荡培养过夜；调整A600值至0.5；接种PAO1菌液于预先放置灭菌盖玻片(8mm×8mm，作为黏附载体)的24孔细胞培养板中，每孔1ml；37℃，分4个不同时间段6h、1d、3d、6d孵育，隔日换液，每个时间段重复5次。 dedecms.com
1.2 激光共聚焦显微镜观察
氩激光(488nm)激发，物镜×20，每个模型由外(BF游离的一面)向内(BF和玻片相贴的一面)逐层扫描(沿Z轴扫描)，每个标本扫描8～16张。
1.3 运用ISA软件对PAO1菌株BF结构定量化分析
将上述获得的各时间组模型图片堆调入ISA3D软件，确认图片的完整性及顺序后运行ISA及ISA3D命令，运行结果包括：①结构参数：如结构熵(textural entropy，TE)、结构能(energy，E)、均一性(homogeneity，H)；②平面参数：区域孔率(areal porosity，AP)、平均扩散距离(average diffusion distance，ADD)、最大扩散距离(maximum diffusion distance，MDD)等指标；③其它参数：如生物量(biovolume，BV)、比表面积(surface area between biomass and void，SA)、单位面积生物膜体积(biomass volume to surface area ratio，V2SA)等［3］。输出数据以EXCEL格式保存。
2 结果
2.1 GFP标记的PAO1菌株构建与发光表型观察
通过电转化方法对PAO1菌株进行了pGFPuv标记。转化菌株自然光下即可见绿色荧光，在紫外灯下发出强绿色荧光；荧光显微镜下，转化菌株菌体发出明亮的绿色荧光，细菌形态呈短棒状，提示pGFPuv已经成功转入了PAO1菌株中，该转化菌株可以作为BF空间结构定量化分析研究的模式菌。
2.2 转化菌株质粒提取鉴定及双酶切鉴定
转化菌株抽提质粒后，电泳结果显示在2000和3500bp之间有一条约3300bp带，条带与质粒大小吻合。提取的质粒进行EcoRI和HindIII双酶切，电泳显示在2000和3500bp之间有一条约2500bp带，在500和1000bp之间有一条约800bp带，与预期结果吻合，提示pGFPuv已成功转入PAO1菌株，并以游离质粒形式表达。
2.3 CLSM观察GFP标记BF模型
6h左右，PAO1已经在玻片上黏附聚集，发出绿色荧光；1d组模型多为绿色荧光，细菌呈微菌落聚集，已具有一定厚度；随着时间延长，BF变厚，3d组及
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