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一个母系遗传非综合征耳聋大家系及mtDNA 12SrRNA基因突变研究 |
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较研究，发现该家系中全部患者和4个母系亲属有mtDNA A1555G突变，而家系中正常配偶和对照组的mtDNA 1555位点均无突变。对7445位点研究结果表明该家系mtDNA7445位点没有发现突变。提示mtDNA A1555G位点突变是导致该家系患者致聋的主要因素之一。
1 材料与方法
1.1 家系资料 耳聋大家系共5代483人，其中耳聋患者137人。患者发病年龄不同，包括先天性发病和进行性发病。我们选取该大家系一分支进行研究，该分支家系包括4代41人(图1)，其中耳聋患者16人(均为非综合征耳聋)，全部患者均经系统的听力检测后确诊。
图1 耳聋核心家系图
Fig 1 A deafness nuclear pedigree
1.2 正常个体血样 100名正常个体，来自江苏南京、淮阴地区，男女比例接近1∶1，年龄20～40岁。
1.3 方法
1.3.1 DNA提取 家系的全体成员和正常个体静脉血5～10ml，按常规方法提取DNA。
1.3.2 PCR引物合成及PCR反应 1555位点引物为线粒体nt1326-1355和nt1684-1704。7445位点引物为线粒体nt7178-7198和nt7821-7840。全部引物均由上海生工(Sangon)公司合成，使用PE2400PCR扩增仪。PCR反应参数为：94℃，变性4分钟；94℃，45秒；60℃，45秒；72℃，45秒，35个循环。
1.3.3 PCR产物纯化和酶切 (1)PCR产物纯化：使用宝灵曼(Boehringer Mannheim)公司High pure PCR product purification kit。按使用说明操作；(2)限制性内切酶消化：1555位点PCR产物10μl加入限制内切酶Alw26Ⅰ(MBI公司)10U，37℃，2小时。1.5%琼脂糖凝胶电泳。7445位点PCR产物10μl加入限制性内切酶Xba Ⅰ(MBI公司)10U，37℃，2小时。2%琼脂糖凝胶电泳。
1.3.4 PCR-SSCP银染 PCR产物5μl，甲酰胺10μl，终止液5μl，6%聚丙烯酰胺凝胶电泳，按常规方法银染。
1.3.5 PCR产物克隆和测序 (1)连接反应：T4 DNA ligase buffer 1μl，PEGM-TVector 1μl,PCR纯化产物1μl，DNA ligase 1μl，ddH2O 6μl，4℃连接24小时；(2)常规法转化细菌DH5α，涂在含X-gal的LB固体培养基上，37℃培养，选取板上的白色菌落，重新划线培养。单菌落PCR检测，证实有插入片段的阳性克隆后，碱法提取质粒；(3)使用T7启动子引物，377全自动测序仪测序。
2 结果
2.1 7445位点的PCR扩增和酶切结果 引物nt7178-7198,nt7821-7840扩增可见1条662bp扩增带，正常个体mtDNA7445位点包括XbaⅠ酶切位点TCTAGA(7445)，如有A7445G突变，XbaⅠ酶切位点消失。我们对家系中41例标本使用nt7178-7198，nt7821-7840引物扩增，XbaⅠ酶切结果表明，家系中全部成员mtDNA扩增产物均可被XbaⅠ消化，产生400bp和262bp的带(图2)，该结果表明此家系中没有发现mtDNA A7445G突变。同时SSCP检测也未发现mtDNA不同的带型。
图2 家系成员mtDNA7445扩增产物用XbaⅠ酶切结果 家系中正常个体和患者均可产生400bp和262bp的带，表明其7445位点为A
Fig 2 mtDNA 7445 PCR product digested with XbaⅠ The patients and marry-in controls show the same bands
2.2 mtDNA1555位点PCR扩增和酶切结果 使用引物mtDNA nt1326-1355，nt1684-1704扩增家系中所有成员和100名正常对照，均可见1条379bp扩增带，正常个体mtDNA1555位点包含有Alw-26Ⅰ切割识别位点GAGA(1555)C，使用Alw-26Ⅰ消化PCR扩增产物可见2条带，分别为153bp和226bp。当mtDNA A1555G突变存在时该酶切位点消失，酶切后仅有379bp的带，使用Alw26Ⅰ对PCR产物酶切，结上一页 [1] [2] [3] 下一页
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