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APA微囊对免疫细胞和细胞因子隔离效应的研究 |
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生存的原理和基础，本文选 择NK细胞、IL-2和TNF-α为代表，测定了APA微囊对免疫细 胞和细胞因子的隔离效应。
1 材料与方法
1.1 微囊化细胞的制备 将细胞悬浮于1.5%的海藻酸钠溶液中，用静电微囊制作仪（购自加拿大多伦多大学生理 系）喷入0.1 mol/L氯化钙溶液中；再依次用0.05%的多聚赖氨酸溶液和 0.15%的海藻酸钠溶液包裹，最后用55 mmol/L的柠檬酸钠溶液液化微珠核心，形成APA微囊 化细胞。
1.2 NK细胞对裸露和微囊化K562细胞的细胞毒作用的测定 参考常规NK细 胞活性测定方法［5］，取新鲜献血员血制备效应细胞悬液。将100 μl含裸 露或微囊化K562细胞的悬液加入96孔板中，1×104细胞/孔，再按不同的效靶细胞比分别 加 入效应细胞悬液。37℃孵育18 h后，裸露靶细胞组以台盼蓝染色法计数每孔K562细胞死亡率 ，微囊化靶细胞组用培养液洗去淋巴细胞，吸取少量微囊置于载玻片上，滴加台盼蓝染液并 加盖盖玻片，轻压盖片使囊内细胞散出，计数K562细胞死亡率。结果按下式计算：自然杀伤率（%）= 实验组细胞死亡率—对照组细胞死亡率。
1.3 IL-2对裸露和微囊化CTLL-2细胞生长的影响 制备微囊化CTLL-2细 胞，计数平均每个微囊所含细胞数和细胞活率。将等量裸露或微囊 化的CTLL-2细胞用含不同浓度IL-2的1640培养液培养，分别于培养后第1、3和5天， 以台盼蓝染色法测定CTLL-2细胞的活率。
1.4 TNF-α对裸露和微囊化L929细胞杀伤作用的测定 将L929细胞制成2. 5×105ml-1的细胞悬液，接种96孔板，每孔100 μl，37℃培养18 h。弃 去培养液，加入含1 μg/ml放线菌素D和不同浓度TNF-α的1640培养液，继续培养20 h。弃 去 培养液，细胞用50 μl 0.2%的结晶紫乙醇-水溶液(2∶98,v/v)室温染色10 m in，蒸馏水漂洗，室温晾干，加100 μl 1%SDS，待紫色物质溶解后，酶标仪595 nm比色。制备微囊化L929细胞，将适量微囊转移入24孔板中，加入1 ml含放线菌素D和不同浓度T NF-α 的培养液，使细胞终浓度同裸露细胞终浓度，37℃培养20 h。吸取少量微囊置于载玻片上， 台盼蓝染色计数各孔微囊化L929细胞的死亡率。
2 结果
2.1 微囊对NK细胞介导的细胞毒作用的隔离效果 将人外周血NK细胞与其敏感靶细胞K562细胞共培养，从表1可看出，随着效靶细胞比的 增加，NK细胞对裸露靶细胞的自然杀伤率明显升高。但是将K562靶细胞用APA微囊包裹后， 则发现在各效靶细胞比例下，NK细胞对微囊化细胞均无明显杀伤作用，表明APA微囊可有效 地保护囊内细胞不受囊外细胞毒细胞的杀伤作用。
2.2 APA微囊对IL-2的通透性 将CTLL-2细胞用微囊包裹，包囊前后细胞活率 分别为98.4%和94.9%，平均294个细胞/囊。将裸露和微囊化细胞于含不同浓度IL-2的 培 养液中 培养不同时间后，其细 胞活率如图1所示，裸露和囊化细胞活率均随IL-2浓度的增加而提高 ，随培养时间的延长而降低，表明IL-2能够通过微囊膜进入囊内并支持囊内细胞的存 活。但 是，在24和48 h时的各IL-2浓度点，囊化细胞的活率均低于裸露细胞，提示扩散到微囊 内的IL-2浓度可能低于囊外培养液中IL-2浓度，故在一定程度上限制了囊内细胞的生 长。
表1 NK细胞对裸露和微囊化K562细胞的杀伤作用(, n=3)[ WTHZ
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