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地塞米松对HUVEC表达粘附分子的影响 |
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度，rIL-1，10万U／ml，rTNF α 5万U／ml，购于北京邦定生物医学公司。Anti-ICAM-1，1．2mg／ml，Anti-ELAM-1，1．8mg／ml，British Biotechnology（Oxford UK）产品，均为小鼠IgG1。rIL-1ra 650 μg／ml，北京医科大学免疫学教研室马大龙教授惠赠。地塞米松5mg／ml，济南永宁制药公司。LPS，5mg／ml，为Sigma公司产品。
1.2 方法
1.2.1 HUVEC原代培养：将正常分娩12h内的脐带，用pH7．2的PBS冲洗其静脉至肉眼无色为止，然后注入0．25％胰蛋白酶，置37°C水浴15～18min，收集脐静脉内消化液，再用20％FCS的RPMI 1640培养液灌洗。离心后弃上清，以20％FCS的RPMI1640制成细胞悬液，调整细胞密度分种于1％明胶预包被的96孔板上，置37°C 5％CO2条件下培养。至形成致密单层后，去除培养上清，冲洗后的HUVEC单层用于ICAM-1和ELAM-1表达试验。
1.2.2 粘附分子ICAM-Ⅰ和ELAM-1表达的诱导：在含有HUVEC单层的96孔板内，分别加入rTNFα 500U／ml，rIL-1 100 U／ml或LPS 1 μg／ml诱导6h，测ICAM-1和ELAM-1的表达。采用rTNFα 500U／ml，rIL-1 100U／ml，LPS 1μg／ml分别和地塞米松100 nM同时作用HUVEC 6h。加不同浓度的地塞米松与1 μg／ml LPS诱导HUVEC 6h。rIL-1（1μg／ml）和rIL-1（1 μg／ml）＋地塞米松（10nM）诱导HUVEC 6h，测ICAM-1和ELAM-1表达。rIL-1ra处理后的HUVEC，然后用rIL-1诱导。
1.2.3 ICAM-1和ELAM-1抗原的检测［3］：细胞因子作用后的HUVEC单层，用pH7．2的PBS冲洗两遍，用1％戊二醛4°C固定30min，用含0．05％ Tween 20的PBS洗板3次，用3％BSA封闭40min，200 μl／孔，洗板后加入鼠抗人ICAM-1（0．4μg／ml）或ELAM-1（0．6μg／ml）单抗，50μl／孔，37°C置1h，洗板3次后加HRP标记的羊抗鼠IgG 100 μl／孔，37°C 1h，预温结束加TBM-H2O2 100 μl，37°C显色15min，加2N H2SO4终止反应。450nm处读取光密度值。实验测定OD450＝刺激组OD450－本底对照OD450。ICAM-1和ELAM-1表达以下列公式计算：
1.2.4 统计学处理：采用t检验
2 结果
2.1 rTNF α、rIL-1及LPS对HUVE表达ICAM-1和ELAM-1的影响 选用rTNF α 500U／ml，rIL-1 100U／ml，LPS 1 μg／ml诱导HUVEC单层6h，测ICAM-1和ELAM-1的表达。结果显示，3种诱导因子均可明显诱导2种粘附分子的表达，明显高于未刺激的HUVEC（P＜0．05）。两种粘附分子的表达之间未见明显差异（P＞0．05），见图1。
图1 rTNFα，rIL-1及LPS对HUVEC表达ICAM-1和ELAM-1的影响（n＝8）
Fig 1 Effects of rTNFα，rIL-1 and LPS on expression of ICAM-1 and ELAM-1 by HUVEC（n＝8）
2.2 地塞米松对rTNFα、rIL-1和LPS诱导的HVUEC表达ELAM-1的影响 采用rTNFα 500U／ml，rIL-1 100U／ml，LPS1μg／ml，分别和地塞米松100 nM同时作用HUVEC6h，刺激因子诱导的ELAM-1表达以百分对照表达的百分率表示，见图2。结果显示，地塞米松明显抑制rIL-1和LPS诱导的ELAM-1表达。100 nM的地塞米松可使rIL-1诱导的ELAM-1表达下降60％；使LPS诱导的ELAM-1表达降69％；而对rTNFα诱导的ELAM-1表达无影响。
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