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一种新的人细胞色素P450 2A6 cDNA克隆 |
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lele of CYP2A6.
［MeSH］ Cytochromes； DNA；Cloning, molecular
细胞色素P450(cytochrome P450, CYP)是一种含血红素酶，广泛存在于细菌和动植物中。参与氧化还原代谢内源和外源化合物。哺乳动物肝微粒体中的CYP能代谢外源化合物如药物、杀虫剂、环境污染物、致突变剂和致癌剂。因为许多毒物、致突变剂和致癌剂需要经过代谢活化，才能与细胞内的大分子作用，产生毒理学作用。因此，建立能稳定表达CYP的转基因细胞可用于化合物毒理学的快速检测。CYP2A6可代谢活化黄曲霉素B1、苯并芘、N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺和烟草特异的亚硝胺类等［1］。本实验室在构建CYP2A6转基因细胞过程中，发现了一种新的人CYP2A6 cDNA序列。
材 料 和 方 法
一、聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)引物, 测序引物除T3购于华美生物公司外均由上海生工生物工程有限公司合成，TRIzol Reagent, M-MLV逆转录酶购自Gibco公司，T4 DNA连接酶，dNTP,Tag 聚合酶,核酸内切酶购自Promega公司。DNA测序试剂盒购于Perkin-Elmer
公司。菌株和质粒由教研室保存。其它化学试剂均为分析纯试剂。
二、 引物设计
根据Yamano 等［2］发表的CYP2A6 cDNA序列，选择其5′端和3′端分别为两侧引物的起始端，扩增cDNA片段长度为1628 bp,上下引物分别为23mer和25mer, 5′端引物从cDNA起始碱基开始，设有Kpn I酶切位点，5′-GGTACCACCATGCTGGCCTCAGG-3′。 3′端引物从1628位碱基开始到1604位碱基为止，设有Xho I酶切位点, 5′ -TCCCTCGAGCCACCACGCCCCTTCC-3′。
三、人肝组织总RNA提取
取手术切除的人肝癌旁肝组织，以TRIzol Reagent, 按操作说明提取总RNA，用紫外分光光度计测定和甲醛变性凝胶电泳确定RNA的浓度，纯度和完整性［3］。
四、RT-PCR扩增CYP2A6 cDNA 5 μg总RNA加Oligo(dT)12C约200 ng及去离子水，65℃变性15 min,在冰浴中依次加5×逆转录酶缓冲液4 μL， 2.5 mmol.L-1dNTP 4 μL, M-MLV逆转录酶1 μL(200 U），终体积为20 μL。37℃ 2 h。90℃ 3 min 灭活M-MLV酶。取10 μL,加10×PCR缓冲液8 μL，2.5 mmol.L-1dNTP 1 μL, 上下游引物各10 pmol,Tag聚合酶5 U，加去离子水至终体积100 μL。循环参数，94℃ 3 min后，94℃1 min,62℃1 min,72℃ 2 min, 循环35次，最后，72℃ 10 min。取10 μL 反应液在1%琼脂糖凝胶上电泳检测。
五、 pBluescript-CYP2A6重组质粒的构建
CYP2A6 PCR产物用乙醇沉淀,用Xho I和Kpn I酶切，载体pBluescript也用这两种酶切后，T4 DNA连接酶连接。将连接产物转化于感受态细菌JM109。在含X-gal和IPTG的氨苄青霉素LB平板上筛选白色克隆。转化菌经扩增后提取重组质粒pBluescript-CYP2A6［3］。
六、克隆片段的全序列分析
用T7，T3和重新设计的两条中间引物，5′-AAGTGCTGGGGATTGAAGTC-3′，5′-ATCGAGGAGCGCATCCAGGA-3′。根据Perkin-Elmer公司操作说明书，用BigDye标记的双脱氧链终止法反应试剂盒反应后，在本实验室 ABI Prism 310全自动毛细管电泳测序仪上对重组质粒pBluescript-CYP2A6 中的CYP2A6片段测序。
结 果
所克隆的CYP2A6 cDNA位于pBluescript载体的多克隆位点之间, 两端为T7和T3启动子。见图1。
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