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肥厚型心肌病患者心肌mtDNA大片段缺失的探讨 |
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rTth DNA聚合酶3u,模板DNA 0.3~0.5μg,将200μl eppendorf管置于DNA热循环仪中(Biorad 公司产),按以下程序扩增,94℃ 1min后,以94℃ 15sec、68℃8min 15sec循环16次,继以94℃15sec、68℃ 8min15sec~11min 15sec循环16次,72 ℃延伸15min以使反应完全。 引物移位大片段扩增:具体步骤同大片段扩增,引物用L2~H2,循环条件为 94℃ 1min后 以94℃ 15sec、59℃1min、72℃6min15sec 循环16 次,继以 94 ℃15sec、59℃1min、72℃6min15sec~9min15sec循环16次,72℃延伸15min。 1.2.3 琼脂糖凝胶电泳 1×TBE为电泳缓冲液,配制0.8%胶,上样后,5V/cm电泳,指示剂迁移至适当位置,在紫外灯下观察结果并摄像。
2 结果与讨论
10例正常引产胎儿及2例HCM患者心肌mtDNA经L1~H1扩增后,均出现一特异性13.7kb带,而一38岁男性HCM患者仅出现一条约为9kb带(见图1),提示该患者心肌mtDNA中存在近5.0缺失。
图1 大片段扩增结果 M.λDNA/EcoRI HindⅢ marker; 1~10.10例正常引产胎儿心肌标本; 11~13. 3例肥厚型心肌病患者心肌标本。
经L2~H2扩增后,该例HCM患者心肌mtDNA仅出现一条约为6kb带,正常引产胎儿及另2例HCM患者出现一特异性10.8kb带(见图2)。L1~H1转换到L2~H2后,所能扩增片段也相应缩短3kb,证明其mtDNA中确实存在近5.0kb缺失。
图2 引物移位大片段扩增结果 M.λDNA/EcoRI HindⅢ marker; 1、3、5. mtDNA有缺失的HCM患者心肌标本3次扩增结果; 2、4. mtDNA无缺失的HCM患者心肌标本; 6. 正常引产胎儿心肌标本。
线粒体OXPHOS产生的ATP对于心脏维持正常功能至关重要,mtDNA缺失会直接影响这一产能途径,使ATP生成减少,导致心脏功能异常。本文在一例HCM患者(男,38岁,因劳累后心悸气短三年,加重半月,拟行手术治疗入院)心肌mtDNA 中发现近5.0kb的缺失,缺失区域编码呼吸链复合物Ⅰ、Ⅳ、 Ⅴ中的部分蛋白质亚单位。复合物Ⅰ~Ⅳ组成电子传递链,来自线粒体外的电子经复合物Ⅰ传递至线粒体内,再经过复合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ传递至O2,通过氧化磷酸化偶联机制驱动ATP合成, 因此, mtDNA5.0kb缺失导致复合物Ⅰ、Ⅳ的缺陷会影响OXPHOS功能。 由于缺失片段位于轻链复制点(OL)之间,不包括OH本身,且mtDNA复制转录的酶由核DNA编码而使mtDNA复制速度与其长度呈正相关,因此, 缺失型mtDNA复制较快,在组织中含量得以富集;另一方面,由于成年后 OXPHOS功能在正常情况下也呈逐年下降趋势〔5〕,且缺失型mtDNA会使OXPHOS过程受阻而且使氧自由基增加,氧自由基又会进一步加重mtDNA的缺失〔2〕。在mtDNA 缺失与OXPHOS功能之间形成一恶性循环,这一过程促使心肌形态、结构发生相应改变,当OXPHOS产生的ATP不再能满足心脏维持正常功能所需能量的阈值时,患者就表现出明显的心功能不全症状。由于OXPHOS功能是由核DNA与mtDNA 共同调控的,所以在OXPHOS功能未达到阈值以前,组织细胞内的mtDNA即使完全为突变型,线粒体产生的能量仍能满足组织正常活动的需要而使患者不表现出症状〔6〕。
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