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黄芪对感染病毒大鼠心肌细胞钙通道及钠钙交换载体的效应 |
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ects of CVB3 to L-type voltage depend e nt calcium channel and Na＋/Ca2＋ exchange, AM could prevent intracellu lar calcium overload and abnormal electric activities caused by virus infection.
MeSH Astragalus membranaceus;Coxsackieviruses;Calcium channels;My ocardium;Rats
黄芪(astragalus membranaceus,AM)是一种中医学认为具有补气作用 的中药，因具有调节免疫［1-2］抗病毒［3］、清除氧自由基［4］ 和 改善心功能［5］等作用，近年来被用于病毒性心肌炎的治疗［6］。细胞内钙 超载是多种原因导致细胞损害的共同途经，病毒感染可引起细胞跨膜钙离子内流增加［ 7］，说明钙离子可能参与病毒介导的细胞损伤。本文利用全细胞膜片钳技术探讨黄芪对 感染柯萨奇B3病毒(CVB3)大鼠心肌细胞L型钙通道(L type voltage dependent calci um channel,LVDCC)、钠离子通道及钠钙交换载体(Na+/Ca2+ exchange,NCE)的效应 ，以了解黄芪对细胞内钙平衡的影响，旨在为临床上应用黄芪治疗心肌炎提供实验依据。
材料与方法
心肌细胞的分离：用胶原酶灌流法获得SD大鼠单个心室肌细胞［8］。各 实验组细胞均于37℃下温育2 h后用于膜片钳记录。温育和贮存在EMEM营养液中进行。
实验分组：(1)N：正常对照组。分N1、N2、N3组，分别用LVDCC电流、Na ＋电流及NCE电流的测量。(2)AM：黄芪对照组。分AM1、AM2、AM3组，相应于N 1、N2、N3组。(3)V：病毒感染组。分为V1、V2、V3组，相应于N1、N 2、N3组。1×105／mL细胞接种200TCID50的CVB3。(4）VAM：病 毒感染加黄芪处理组，分VAM1、VAM2、VAM3组，相应于N1、N2、N3组。各组以 最终记录到的细胞数统计。黄芪的用量参照文献［7］，以EMEM配制 ，其终浓度为0.2 g/mL(黄芪注射液4 g/2 mL，上海福达制药厂，批号941207)。 记录时细胞外液加入同样浓度的黄芪。
全细胞膜片钳记录：利用Hamill法［9］记录全细胞跨膜电 流。将 细胞置于倒置显微镜上盛有台氏液的玻璃凹槽中，自然沉淀3～5 min，使其贴壁。玻璃微 电极用二步微电极拉制仪拉制(PP-83，Japan）。尖端直径1～3μm，阻抗2～4MΩ。全 细胞钳制形成后，台氏液转换成相应的测试外液。电压钳制由EPC-9放大器和Macintosh 计算机运行的Pulse＋pulsefit8.0软件操纵(German,HEKA)。记录LVDCC电流时，保持电压在 -50 mV以灭活T型Ca2＋通道电流和Na＋通道电流，测试电压脉冲从-40mV到+60 mV ，步增10 mV，脉宽100 ms，频率0.5Hz。记录Na＋通道电流时保持电压在-90 mV，测试电 压脉冲从-80 mV到+60 mV，步增10 mV，脉宽20 ms，频率0.5Hz。记录NCE电流时采用斜坡电 压，保持电压在-40 mV，测试电压脉中从-40 mV→+60 mV→-120 mV→-40 mV，速度为180 m V/s。采样结果由计算机自动记录和处理。对于LVDCC电流和Na＋通道电流以平均膜电 流与膜电容（Cm）比表示其电流密度(Id），单位为pA/pF。对于NCE电流，仅计 算-80 mV和+40mV电压时的膜电流密度Id-80mV与Id＋40mV，单位为p A/pF；同时记录NCE的逆转电位Vr。
溶液制备(mmol/L):(1)测钙电流电极外液：Tetraethylammonium chloride(TEAC l) 135;CaCl2 10；MgCl2 1；HEPES 10；glucose 10;TEAOH调节pH至7.4。(2)测钙钠 电流电极内液：CsCl 120;MgCl2 1；Mg-ATP 4;EGTA 10;HEPES 10;CsOH调节pH至7.2。(3 )测钠电流电极外液：TEACl 100;NaCl 20;MgCl2 1;glucose 10;HEPES 10;TEAOH调节pH 至7.4。(4)测钠电流电极内液；CsCl 120; NaCl 10;Mg上一页 [1] [2] [3] 下一页
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