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抗心磷脂抗体检测及其影响因素的研究 |
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其灵敏度和准确性提供客观的实验室依 据。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器 96孔聚苯乙烯板(简称微孔板，Pharmacia)，孵 育箱(日本Fuji公司)；酶标 测读仪(北京新技术应用研究所)；硅胶G(上海化学试剂厂)，心磷脂(自提)，辣根过氧化物 酶(HRP)标记的羊抗人IgG、IgM、IgA(北京军事医学科学院)，其它试剂皆为分析纯。
1.2 检测对象 10份异常SLE血清及10份正常健康人血清。
1.3 ACA的ELISA检测 参照文献［2，5］并加以改进。纯化的心磷 脂以无水乙醇稀释至50 μg/ml，用30 μg/孔包被微孔板，4℃无盖过夜蒸发干燥。用0.01 mo l/L、pH7.3的PBS常规洗板，然后每孔用110 μl、10%新生小牛血清(NBS)/0.01 mol/L PB S封 闭。每孔加100 μl用封闭液1∶50稀释的待测血清，每份样本均做2复孔，每块板均设空白 、 阴性、阳性及参考血清对照；37℃孵育3 h，洗板。用封闭液分别稀释HRP标记的羊抗人IgG( 1∶1 000)、IgM(1∶800)及IgA(1∶500)，每孔加100 μl，37℃孵育1 h，洗板。每孔加100 μl 邻苯二胺-H2O21底物溶液，37℃孵育20 min。每孔加50 μl、2 mol/L硫酸终止反应 。在492 nm波长下测光吸收(A)值。
1.4 血清样品稀释度对ACA测定结果的影响 血清样品(10份异常SLE样品 及10例随机选取的健康成人样品)分别按25倍、50倍、100倍、200倍及400倍稀释后，进行I gG-ACA测定。测定方法同1.3。
1.5 温度对ACA检测的影响 血清样品(10份异常SLE样品及10例随机选取 的健康成人样品)按50倍稀释，分别在22℃、25℃和37℃进行IgG、IgM、IgA-ACA测定。测 定方法同1.3。
1.6 离子强度对ACA测定结果的影响 分别用含有0.03、0.15、0.50 及1.50 mol/L NaCl的PBS按50倍的比例稀释10份异常SLE样品，进行IgG-ACA测 定。测定方法同1.3。
1.7 酶标板包被与检测间隔时间对样品ACA测定结果的影响 酶标板包被 后，4℃静置24 h后分成5组，其中1组进行IgG-ACA的检测，其余4组-20℃保存，并分别 于包被后的第7、14、30和60天进行IgG-ACA的检测。本实验以10例异常的SLE患者及随机抽 取的10例正常人血清样本为检测对象。
2 结果
2.1 血清样品稀释度对ACA检测的影响 通过对10份异常SLE血清及随机选 取的10份正常健康人血清按不同倍数逐级稀释，分别进行IgG-ACA的检测，从倍比稀释曲线 图(图1)可见随稀释倍数增大，光密度值逐步降低。在曲线中点处A值为0.65，此时血清稀 释倍数约为1∶50。
表1 温度对IgG、IgM and IgA-ACA检测结果的影响
Tab.1 Results for IgG、IgM and IgA-ACA levels determined at different t emperatures
Isotype
SLE(n) Absorbance (492 nm)
22℃ 25℃ 37℃
IgG 10 0.91±0.021) 0.96±0.031) 0.61±0.01
IgM 10 0.45±0.05 0.43±0.04 0.38±0.01
IgA 10 0.24±0.02 0.22±0.02 0.19±0.02
Note:1)vs 37℃，P＜0.05
表2 CL包被板与样品检测间隔时间对实验结果的影响
Tab.2 Results for IgG-ACA levels of the same sera sample determined at different time
Subject
n ACA levels (49 nm)
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