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同型半胱氨酸对鸡胚早期心血管发育的影响 |
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o．Conclusion HCY was a new risk factor which could damage cardiovascular development，and folic acid could effectively antagonize its developmental toxicity．Cellular apoptosis might relate to cardiovascular defect．
Key words Cysteine Cardiovascular abnormalities Folic acid Apoptosis
近年大量研究发现，叶酸代谢障碍引起的高同型半胱氨酸（homocysteine，HCY）血症是成人心血管疾病和出生缺陷疾病发生的重要原因之一［1，2］。目前认为，高HCY血症可能与先天性心脏病的发病有关，但对早期心血管发育是否有影响尚未见报道。我们对HCY是否能诱发原始心血管细胞死亡及细胞死亡的性质，补充叶酸和维生素B12是否能缓解HCY对心血管发育的损伤作用等问题进行了研究。
材料与方法
一、材料
白色莱杭鸡种蛋由北京家禽孵化实验场提供，消旋-HCY、叶酸和维生素B12均购自美国Sigma公司，细胞凋亡检测试剂盒购自德国宝灵曼公司。主要仪器有透射和扫描电镜、光学和解剖显微镜、全自动孵化箱及开蛋器等。
二、方法
1.鸡胚培养和分组：种蛋经1‰新洁尔灭清洗，分批入孵化箱，在相对湿度为60％和温度为37.3℃的环境条件下培养，每2小时翻蛋1次。2天和4天后用照蛋器检出活胚，随机分7组；开蛋后分别进行卵黄一次性微量注射。各组注射新鲜配制的HCY剂量依次是0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0和16.0 μmol/胚胎，对照组注射无HCY的PBS溶剂，注射体积为50.0 μl/胚胎；继续培养2天后收获胚胎，镜检。
2.组织病理检查：56只来自不同剂量的鸡胚经固定和石蜡包埋后，行6 μm连续切片。以苏木精-伊红染色法显示胚胎组织结构,以甲基绿-派洛宁染色法显示DNA和RNA的变化［3］。
3.电镜观察：按文献［4］的方法制备扫描和透射样本18例，分别观察心脏表面和内部细胞的超微结构。
4.原位DNA片段末端标记（TUNEL）：按文献［5］进行。DAB-H2O2显色，甲基绿复染后封片和镜检。细胞核中有深棕色颗粒者为凋亡细胞，并按文献［3］的方法计数凋亡细胞百分率。
5.叶酸和维生素B12干预实验：在确定HCY（8.0 μmol/胚胎）能影响早期心血管发育后，对4天龄胚胎在注射HCY的同时给予叶酸（5 μg/胚胎）和维生素B12（1 μg/胚胎），再培养2天后观察干预效果。
6.统计处理：全部数据应用SAS软件进行χ2和趋势性χ2检验。
结果
1．HCY对早期胚胎心血管发育的影响：不同浓度HCY对2天龄和4天龄鸡胚心脏发育的影响见表1。HCY诱导的早期鸡胚心脏缺陷主要表现是心外露、心包积液、异位心和心脏发育过小（停滞在心球管期）。解剖镜下可见8.0 μmol/胚胎HCY对卵黄囊血管分化有明显的抑制作用，抑制率达60.7％（17/28），与对照组的3.7％（2/54）相比差异具有显著性（表2）。
表1 同型半胱氨酸对早期鸡胚心脏发育的损伤(例数)
同型半胱氨酸
(μmol/胚胎) 2天龄 4天龄
活胚胎 心脏缺陷*
活胚胎
心脏缺陷*
例数 百分率
(%) 例数 百分率
(%) 例数 百分率
(%) 例数 百分率
(%)
0
42/47 92.5 1 2.4
54/62 87.1 1
1.9
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