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简便有效分离培养大鼠主动脉内皮细胞的一种新方法 |
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一端，此时翻过来的动脉两端被完全折入封闭。将动脉置于50 mL培养瓶中，加入含有20%胎牛血清的培养液，液体仅遮盖主动脉即可，置于37℃、5%CO2饱和湿度的孵育箱中培养，3 d 换液1次。
1.2.２ 细胞传代培养 原代培养约12 ～14 d，迁出生长的细胞覆盖培养瓶面积的2/3以上，约80 %的细胞汇合即可传代。取出主动脉，用D-Hanks液冲洗培养瓶2次，常规消化、吹打，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入含10% 胎牛血清的DMEM/F12培养液适量，制成细胞悬液，依照细胞的量按1：1或1：2传代培养，3 d换液1次。另9只大鼠以同样步骤重复上述实验。
1.3 免疫细胞化学鉴定 在24孔培养板内放置无菌盖玻片，每孔种植1 mL 含有104个细胞的悬液，待细胞生长至接近汇合时,取出盖玻片，室温下4%的多聚甲醛固定10 min,常规SABC法显示血管内皮细胞标志物Ⅷ因子相关抗原（vWF）。
1.4 细胞纯度分析 取6次培养的第二代主动脉内皮细胞，vWF免疫细胞化学染色后，每张盖玻片400倍镜下随机选5个视野计数细胞，计算细胞阳性表达率（细胞阳性表达率=阳性细胞数/细胞总数）。
2 结果
2.1 形态学 原代培养6～8 d，在动脉附近可见少量的细胞迁出并贴壁生长，细胞呈短梭形或多角形。培养至12 ～14 d，迁移出生长的细胞覆盖培养瓶面积的2/3以上，密度不匀，其中约80 %的细胞汇合成单层，呈现内皮细胞典型的“鹅卵石”样特征（图1）。传代培养的细胞0.5 h开始贴壁，2 h后约90 %的细胞贴壁，4 ～5 d时细胞汇合成单层。培养至9代时，细胞质内有空泡出现，同时出现胞体瘦小，细胞呈现老化状态。
2.2 免疫细胞化学染色 vWF免疫细胞化学染色，细胞质呈现棕黄色阳性反应。每张盖玻片100倍镜下随机选10个视野进行观察，均未见染色阴性表达细胞（图2）。
2.3 细胞纯度分析 vWF免疫细胞化学染色后，每张盖玻片400倍镜下随机选5个视野计数细胞，所见细胞均为阳性染色细胞，阳性表达率为100%，即获取的内皮细胞纯度为100%。
重复实验10次，均获得同样结果。
3 讨论
血管内皮细胞的原代分离与培养是研究其分子生物学特性及相关疾病的重要前提，大鼠是最常用的实验动物之一。长期以来，由于大鼠血管细小，操作难度大，其血管内皮细胞的分离与培养尚缺乏理想的手段。鼠主动脉内皮细胞多采用酶消化法［2-3］和植块法［4－6］。
酶消化法可以在相对短的时间内获取细胞。大鼠主动脉较细，本实验发现150 g的大鼠主动脉管径约2 mm，其分支非常细且不易结扎，灌注的酶消化液容易经其分支渗漏至管外，使外膜也被消化，导致其他细胞混入；细胞产量亦较低，且大多需同时获取多条动脉，操作复杂；有时因酶的活性改变而使消化时间难以掌控,不仅影响内皮细胞的分离和提取，亦可直接影响内皮细胞的活力［7］。
组织块移植培养法操作简单，对细胞活力无损伤，缺点为长出的细胞成分比较复杂，内皮细胞纯度低［8］，常伴有成纤维细胞污染。由于成纤维细胞生长迅速，最终过度生长甚至覆盖内皮细胞而影响内皮细胞增殖。有学者将大鼠主动脉外膜做瞬间热处理后再进行植块培养，提高获取内皮细胞的纯度至67.8%［6］。
本研究采取将大鼠主动脉内膜翻向外、两端内折结扎后直接培养的方法获取血管内皮细胞。结果发现，血管内皮细胞呈现接触性抑制的“鹅卵石”样特征，其标志物vWF表达阳性，未发现杂细胞等，提示获得了数量可观的单一的血管内皮细胞。本研究采用10只大鼠重复实验，均获得了同样的结果，证明该方法具有可重复性。此方法的优势在于：1）获取的血管内皮细胞纯度高、数量多。由于血管两端内折结扎，整段血管仅内膜接触培养瓶，外膜面的细胞不易迁出，经免疫细胞化学染色未发现vWF阴性细胞，有效避免了血管壁其他细胞的混入。一只大鼠的主动脉即可产出5×105个原代内皮细胞，细胞产出量相对较高，经传代培养，可以满足基本实验需要。2）对细胞无损伤。内皮细胞是一种比较娇嫩的细胞。本实验方法无需酶消化，避免了酶消化过程中对细胞的破坏作用，同时节省了酶灌注和消上一页 [1] [2] [3] 下一页
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