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一种简便 快速的大肠杆菌质粒转化方法 |
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郭培懿 陈向东 谢志雄 沈萍
摘 要： 将受体菌与质粒DNA混匀直接在Ca2+离子选择平板上进行转化和筛选，其转化过程仅需2 min左右，并能得到105以上的转化效率, 可满足一般克隆工作的需要。
关键词： 转化;大肠杆菌;Ca2+选择平板
中图分类号： Q933，Q93.039 文献标识码： B 文章编号： 0253-9772(1999)04-0048-51
A Simple and Rapid Method for the Transformation
of Escherichia coli by Plasmids
GUO Pei-yi, CHEN Xiang-dong, XIE Zhi-xiong, SHEN Ping
(College of Life Sciences,Wuhan University,Wuhan430072,China)
Abstract： After mixing the recipient cells and plasmids DNA, directly spread the mixture on selective media containing Ca2+. The whole process of transformation just needs 2 min or so, and could acquire the transformation efficiency of more than 105, which is enough to common gene cloning.
Key words: Transformation;Escherichia coli;Ca2+ selective plate
转化是分子克隆中将外源DNA导入受体细胞的关键技术，自1970年Mandel和Higa发现用CaCl2处理的细菌细胞可被λ噬菌体DNA转染后〔1〕，接着在1972年和1973年Cohen等人用同样的方法首次成功地将R因子和重组质粒DNA导入大肠杆菌细胞（Escherichia coli）〔2, 3〕，而成为基因工程的创始人。此后在转化技术上虽有过不少的改进，但都旨在如何提高转化效率上〔4～6〕，自70年代中期以来, 使“转化效率作为分子克隆中限制因素的时代已一去不复返了”〔7, 8〕。但就方法本身而言一直没有大的变化，而是作为一种常规转化技术一直沿用至今〔8～10〕。该转化技术主要由三部分组成〔8〕：（1）用CaCl2诱导受体细胞使其成为“感受态”；（2）DNA转化受体细胞；（3）涂布平板筛选转化重组子。一般至少需要2 h完成。我们这里介绍一种十分简便迅速的质粒平板转化方法，该方法删除了常规方法中十分费时、繁杂的（1）和（2）二部分的操作，而是直接在Ca2+选择平板上一次完成，整个过程仅需2 min左右，转化效率与常规方法相当，足以满足一般克隆工作的需要。
1 材料和方法
1.1 菌株
大肠杆菌（E. coli）TG1、HB101、DH5α，本实验室保存。
1.2 质粒
pBR322 购自华美生物工程公司；重组质粒pJH由本实验室构建〔11〕；枯草杆菌-大肠杆菌穿梭重组质粒pBE2，中科院微生物学研究所郭兴华先生馈赠〔12〕。
1.3 试剂、培养基及主要缓冲液
Bacto-Tryptone及Yeast extract为英国Oxiod公司生产；氨苄青霉素由华北制药厂生产；RNase、Protease K、BamHI、DNA Marker等均购自华美生物工程公司；其它化学试剂均为分析纯产品。
LB培养基及用于质粒提取、检测的各种缓冲溶液均参照Sambrook等的方法配制〔8〕，而用于平板转化的Ca2+选择平板是在LB固体培养基加入单独灭菌的CaCl2和氨苄青霉素 （终浓度分别为100 mmol/L和100 mg/ml）。
1.4 实验方法
质粒的提取、纯化、酶切、琼脂糖凝胶电泳等均参照文献〔8〕。
传统的CaCl2处理转化方法参见文献〔8〕略做修改：(1) CaCl2处理法制备感受态大肠杆菌：挑取受体菌单菌落接种于5ml LB培养液，37℃培养过夜，以1/100量接种于LB培养基活化至OD600=0.4～0.6[1] [2] 下一页
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