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衰老真皮成纤维细胞胶原基因调控研究 |
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>入调控剂。
3.分组：
①老人表皮细胞组；②老人表皮细胞VBT处理组；③老人成纤维细胞组；④ 老人表皮细
胞EGF处理组；⑤小儿表皮细胞组；⑥老人成纤维细胞SCF处理组；⑦小儿成纤维细胞组；
⑧老人成纤维细胞VBT处理组；⑨老人表皮细胞SCF处理组 ；○10老人成纤维细胞EGF处理组。
调控处理组，在培养基中加入各种调控物质，浓度如下：
VBT 1 mg/ml； ECF 0.2 mg/ml； SCF 1.0 mg/ml
4.调控药品：
EGF：表皮生长因子(上海生化所)；
VBT：维生素BT(上海第二军医大学)；
SCF：胎儿成纤维细胞提取物(上海第二医科大学)。
二、RNA提取
采用异硫氰酸胍一酸一氯仿法。
三、含目的探针的质粒来源
Plasmid PHFS含Ⅲ型前胶原基因控针、Plasmid PHCALIU含Ⅰ型前胶原基因探针，均
由芬兰Turku 大学的Eero Vuorio 教授惠赠。
四、两种cDNA探针制备
1.提取质粒DNA：参考Summerton 方法［1］；
2.胶原cDNA片段的酶切及回收；
3.Ⅰ、Ⅲ型胶原cDNA探针的同位素标记。
用BRL公司的缺口平移试剂盒和Amersham公司的α-32P-dATP进行标记，测定标记探
针放射比活为5×107 cpm/μg。
五、杂交方法(RNA点印迹杂交)：浸湿NC和Whatman 3MM滤纸各1张。
将Whatman 3MM滤纸放在仪器上，加盖拧紧，接到真空泵上，在50 μ 120×SSC中加入1～2μg
待测RNA，加入仪器孔中，关闭真空泵，取下仪器盖及滤膜，NC滤膜夹在2张新的Whatman 3MM滤纸
之间放在真空炉中80 ℃烤2小时，用6×SSC、2×Denbardt 试剂0.1 %SDS 进行预杂交。在预杂交液
中加入变性的放射性标记探针0.2 μg/100 μl，在适宜的温度下继续温育16～24小时，
用1×SSC 0.1 % SDS于室温洗膜20分钟，随后用0.2×SSC 0.1 % SDS于68 ℃洗膜3次，每次20分钟，
用X光片进行放射自显影，于－70 ℃曝光24～48小时［1，2］。
六、杂效斑点图像分析：以Actin作为内对照(Actin 斑点灰度为100%)。
结 果
一、EGF 对老年成纤维细胞胶原基因表达的调控。
表1 EGF对老年成纤维细胞胶原基因表达的影响
EGF Ⅰ Ⅲ
斑点 灰度 斑点 灰度
处理前 40% 45%
处理后 45% 40%
Actin对照
100% 100%
图像分析结果显示EGF对Ⅰ型、Ⅲ型胶原基因的表达无明显调控作用(P＞0.05)。
二、VBT对老年成纤维细胞胶基因表达的调控。
表2 VBT对老年成纤维细胞胶原基因表达的影响
EGF Ⅰ Ⅲ
斑点 灰度 斑点 灰度
处理前 40% 45%
处理后 98% 86%
Actin对照
100% 100%
图像分析结果显示，VBT可使两种胶原基因表达增加，但对Ⅰ型胶原基因的表达调控作用
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