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咪唑安定及异丙酚对大鼠心肌细胞电生理活动的影响 |
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用的静脉麻醉药，临床观察显示两药复合应用其镇静效果呈协同作用，但其对心肌细胞电生理活动的影响目前尚不完全清楚。本研究采用膜片钳技术，观察咪唑安定复合异丙酚对大鼠心肌细胞钙通道电流和动作电位的影响，探讨咪唑安定和异丙酚复合应用时对心肌负性肌力的影响程度及其产生机制。
材料和方法
单个心肌细胞的制备 取250～350gSD大白鼠，雌雄不拘，击枕致昏，快速取出心脏，主动脉插管后固定于改进的Langendorff装置上，行主动脉逆行灌流，先用台氏液灌流3分钟，换无钙台氏液5分钟，然后用含0.02%胶原酶(Ⅱ型，sigma公司)、牛血清白蛋白(BSA)及微量钙的消化液灌流15分钟，取下心脏，剪下心室肌，在KB保护液中把心室肌剪成碎片，用吸管轻轻反复吹打，分离出单个心室肌细胞。在KB保护液中孵化1小时待用。所有灌流液均用100%氧饱和。灌流液温度恒定在37℃，pH7.4。台氏液成分为(mmol.L－1)：NaCl 140，KCl 5．4，MgCl2 0．5，NaH2PO4 0．3，CaCl2 1．8，Glucose 5，HEPES 5，台氏液中去除CaCl2则为无钙台氏液。KB保护液成分为(mmol.L－1)：KOH 70，L-glutamic acid（L-谷氨酸)50，KCl 40，taurine(牛胆素)20，KH2PO4 20，MgCl2 3，Glucose 10，Hepes 10，EGTA(乙二醇双醚四乙酸)0.5。在显微镜下选用细长杆状，横纹清晰，边缘光滑的心肌细胞进行实验研究。
钙通道离子电流和动作电位的测定 用相差倒置显微镜观察贴附于灌流槽底部的心肌细胞并以3～4ml/min正常台氏液灌流。利用液压三维操纵仪(Narishige，日本)使玻璃微电极轻压在细胞表面，用微弱负压(-10cmH2O，1cmH2O＝0.098kPa)使电极尖端与细胞表面形成1～30 GΩ的高阻抗封接后，加大负压(-30～100cmH2O)吸破细胞膜，补偿电容电流和电极串联阻抗，形成全细胞状态。信号经Ag/AgCl电极引导，由CEZ-2400膜片钳生物放大器(日本)放大。玻璃微电极尖端内径为2～4μm，充灌电极液后其阻抗为2～5 MΩ。数据采集频率为4 kHz，滤波为1 kHz。所有数据均经微机储存分析处理。记录L-钙电流(Ica)时，钳制电位保持－40 mV，以失活钠通道及T型钙通道。刺激波宽250ms，频率0.1 Hz，试验脉冲从－30 mV到+40 mV，每次递增10 mV。记录L-钙通道的电极内液成分为(mmol.L－1)：CsCl 80，CsOH 40，MgCl2 2，EGTA 10，HEPES 10，pH 7．3。记录动作电位的电极内液(mmol.L－1))：KCl 140，MgCl2 2，EGTA 2，HEPES 5，NaATP 4，pH 7．4。待钙通道电流稳定后，分别用含咪唑安定3μmol.L－1或15μmol.L－1，异丙酚50μmol.L－1或250μmol.L－1(n＝5只)，咪唑安定1.5μmol.L－1+异丙酚25μmol.L－1或咪唑安定7.5μmol.L－1+异丙酚125μmol.L－1(n＝5只)的台氏液灌流，观察心肌细胞灌流5分钟以及洗去上述药物后，钙通道电流及动作电位幅度和时程的变化。
数据以均数±标准差(±s)表示，采用t检验进行统计学分析，以P＜0.05为有显著性差异。
结果
对钙通道电流的影响 保持钳制电位-40mV，去极化至0mV，时程250ms，在该条件下钠通道完全失活，可引出一内向电流，2.0μmol.L－1异搏定作用5分钟，能完全阻断该电流，表明该脉冲引出的内向电流为L-钙通道电流(Ica)。以去极化至0mV时的Ica最大值为观察指标，显示咪唑安定3μmol.L－1或15μmol.L－1、异丙酚50μmol.L－1或250μmol.L－1分别使Ica较用药前下降18.8%和42.0%、29.2%和52.5%(P均＜0.05，n＝5)。。按上述剂量两药复合应用时则使Ica较用药前下降21.2%和43.8%(P＜0.05，n＝5)。洗去上述药物后Ica可基本恢复至基础值。
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