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单精子卵胞浆内穿刺术治疗男性不育症的探讨 附23例报告 |
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25～43岁，平均32.5岁。不育年限2～12年。4例为继发性不育，19例为原发性不育。3例在外院行常规IVF或ICSI治疗失败，其余20例均系首次治疗。11例系严重精液异常；12例系梗阻性无精子症，其中2例为先天性双侧输精管缺如，10例为炎症性附睾梗阻。2例先天性双侧输精管缺如和8例精子密度少于5×109/L的患者行染色体核型检查，均为46，XY。
1.2 治疗方法
1.2.1 女方超促排卵及处理：治疗前，女方使用促性腺激素释放激素激动剂（GnRH）、卵泡刺激素（FSH）和人绒毛膜促性腺激素（HCG）行常规超促排卵〔2〕，经阴道B超行卵泡抽吸术获得卵子。在ICSI操作之前，将卵丘复合物置于含透明质酸酶16×104 IU/L及含10%母体灭活血清的HTF-Hepes中剥离颗粒细胞。
1.2.2 精子获取及处理：精液异常者在禁欲3 d后(取卵当天)手淫获得精液，采用Percoll或微量Percoll的方法收集活动精子。无精子症者首先行经皮附睾精子抽吸术（PESA），如附睾液中未发现精子，则立即行睾丸精子获取术（TESE）。经开放性睾丸活检术获得米粒大小睾丸组织，放入HTF-Hepes(Irvine scientific,9529)中，将睾丸组织在培养皿底部的井字划痕上来回搓动，将睾丸精曲小管磨碎，在含精曲小管组织碎片的培养液中可找到睾丸精子。为改善精子活动力，附睾和睾丸精子可行短期培养。在作ICSI前，精子需用含10%母体灭活血清的HTF-Hepes洗涤3次。
1.2.3 ICSI操作：ICSI操作参照Payne〔3〕介绍的方法进行。采用商品化的ICSI注射针，内外径为5和7 μm。自制ICSI持针，尖端内外径为20和100～120 μm。ICSI操作在配有微分干涉光学系统（DIC）的Zeiss倒置显微镜的温台(37℃)上进行。采用两个粗调操作器和两个液压细调操作器(MN-188和MO-188，Narishige)控制显微持针和注射针的移动。一个显微注射器控制显微持针内的压力吸引固定卵子，而精子的吸取和注射及卵胞浆的抽吸由内充硅油的1 ml一次性注射器控制。
按下法制作ICSI操作皿：将5 μl的10% PVP(Irvine scientific,99219)置于Petri皿(Falcon 1006，Beckon dickison)中央，在PVP微滴周围放置8个5 μl的含10%母体灭活血清的HTF-Hepes微滴，尽快用石蜡油(M8410，Sigma)遮盖微滴，以免渗透压改变。
在ICSI操作前，将处理后的精子放入1～2个HTF-Hepes微滴，而将卵子放入其他的HTF-Hepes微滴，每次卵子总数少于5个。在精子微滴中选择形态正常的活动精子转移到PVP微滴中，用ICSI注射针在培养皿底部猛烈划破精子的尾部，将制动的精子吸入注射针，尾部先吸入，使精子置于注射针尖端。将含精子的显微注射针和持针放入含卵子的微滴中，MII期的卵子由持针吸引固定，使第一极体位于12或6点的位置。将ICSI注射针穿过透明带刺入卵子胞浆内，回抽部分胞浆后将回抽的胞浆和精子注入卵子，缓慢退出注射针。重复以上过程，对每个MII期卵子行ICSI。
1.2.4 穿刺卵培养：将穿刺后的卵子置于含10%母体灭活血清的Earle′s（Sigma，E2888）或HTF培养液（Irvine scientific, 9528）中，在37℃含5%CO2的湿化空气中培养。16～18 h后观察注射卵子是否正常受精，即是否有2个原核和2个极体。穿刺后40～48 h观察有否卵裂。
1.2.5 胚胎转移和妊娠观察：受精后24～32 h,将不超过4个形态学评分的最佳胚胎经阴道植入子宫。2周后检测尿和血HCG，确定是否妊娠，5周后B超观察妊娠囊和搏动胎心数目，以确定是否临床妊娠和多胎妊娠。
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