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国产左炔诺孕酮诱发人精子染色体畸变的体外实验 |
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厉广坤 蔡敏 黄秀君 冯华 舒丽贞 李练兵 鄢采芹 计垣
左炔诺孕酮(LNG)是一种亲脂性孕激素，其合成制品长期用于女性避孕。LNG的临床安全性研究已有报道，但关于遗传效应研究的报道较少。我们采用人精子染色体离体测试系统，观察国产LNG对人精子染色体的致畸变作用，以探讨LNG的遗传安全性。
一、材料和方法
1.主要试剂、材料：LNG为丹东市鸭绿江制药厂生产，人血清白蛋白为上海生物制品研究所产品，钙离子载体为美国Sigma公司产品，平阳霉素为天津市河北制药厂产品。人精液标本取自半年内无放射线及诱变药物接触史、生育过至少一个健康子女且无其他异常生殖史的健康男性自愿供精者，禁欲3～5天，手淫法采精。金黄地鼠卵取自5～10周龄雌性金黄地鼠。
2.实验方法：(1)BWW液、异合卵培养基按黄天华等［1］报道的方法配制。(2)人精液液化后，洗涤、爬高，收集高活力精子，经钙离子载体处理5～10分钟，待有50%左右的精子不动时，离心、洗涤1次。沉淀精子中加入获能液(含3.5%人血清白蛋白的BWW液)10 ml充分混匀，分置于5支离心管中(每管2 ml)。其中，3管加入LNG，使终浓度分别为0.909 ng/ml、2.880 ng/ml、9.090 ng/ml(实验1，2，3管)；1管中加入平阳霉素(阳性对照)，使终浓度为40 μg/ml；1管为阴性对照。5支离心管均置二氧化碳培养箱中(37℃)处理或获能3.5小时。收集处理或获能后的精子，洗涤2～3次后，分别在5个培养皿内制成含有精样的液滴，以备与金黄地鼠卵受精。金黄地鼠超促排卵、人精子穿透去透明带金黄地鼠卵、异合卵培养及精子染色体制备等程序参照文献［1］。
3.观察指标：油镜下每管观察50～100套精子单倍体核型，计数其中的畸变单倍体数和断裂数。凡是1个精子单倍体核型中存在结构畸变(≥1次)均计为1个畸变精子单倍体核型。断片、断裂、裂隙、微小体、末端缺失等计为1个断裂数；环状染色体、双着丝粒染色体、相互易位等各计为2个断裂数，但因伴随互换畸变的断片是这种畸变的一部分，不另计数。用“结构畸变精子率”和“断裂均数”两项指标分析实验结果。结构畸变精子率=(结构畸变单倍体数/分析单倍体数)×100%；断裂均数=发生的断裂总数/分析的单倍体数。
4.统计学方法：采用U检验。阳性对照和阴性对照的两项指标与文献［1］的结果相近，显示该测试系统的稳定性。
二、结果
阳性对照出现的结构畸变(缺失、断裂、环状染色体、相互易位、单体断裂、单体易位、三射体、无着丝粒断片等)，在实验1，2，3管基本上都存在，实验管2项指标随LNG浓度增加呈上升趋势，但差异无显著性(P>0.05)，结果见表1。
表1 LNG诱发人精子染色体畸变实验结果
类别 分析单倍
体数 畸变 断裂
单倍体数 百分比(%) 总数 均数
实验1管 81
4
4.9*
5
0.06*
实验2管 68
4
5.8*
5
0.07*
实验3管 63 6 9.5* 7 0.11*
阳性对照 100 35 35.0** 53 5.30**
阴性对照 100 4 4.0 5 0.05
*与阴性对照比较，P>0.05；与阳性对照比较，P<0.01 **与阴性对照比较，P<0.01
三、讨论
由于人类体细胞对外源性诱变因子的敏感性不同于生殖细胞，不同物种对同一诱变因子的反应也不同，因此，用体细胞或哺乳动物的生殖细胞的遗传效应来推断LNG皮埋剂对人体的遗传效应，有可能带来偏差。本研究采用人精子染色体畸变离体测试系统，观察LNG在体外直接作用于人精子时，染色体的结构畸变情况，评价其对人类生殖的潜在危害及引起子代遗传性疾病、肿瘤和出生缺陷的可能性，较体细胞的遗传效应研究更敏感、更直接。
本研究LNG最低浓度参考了国产LNG皮下埋植剂和其他剂型LNG用于人体时血中的爆破浓度［2，3］，最高浓度约为爆破浓度的10倍量。结果提示，LNG在一定作用时间和浓度范围内具有遗传安全性。由于阴性对照的精液未接触可能的诱变物质，其结果可反映人精子染色体的自发性畸变状况。
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