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精子发生相关基因DYS1的分析 |
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周作民 沙家豪 林 敏 王黎熔 周亚东 朱 虎
(南京医科大学组织学胚胎学教研室，南京 210029)
摘 要 用PCR方法检测了核型正常(46，XY)的95例无精子症患者和35例严重少精
子症患者基因组DNA中的DYS1，发现4例无精子症患者有DYS1的丢失，严重少精子
患者中发现3例有DYS1的丢失。结果表明：应用PCR法检测DYS1基因片段是切实可行
的，对无精子症和严重少精子症患者的病因诊断具有一定的应用价值。
关键词 无精子症 无精子症因子 DYS1基因 多聚酶链反应
精子发生受到基因的调控，由于有关基因的丢失可导致生精障碍，出现严重少精
子或无精子，因此称之为无精子症因子(azoospermia factor, AZF)[1～3]。已经证明AZF位
于Y染色体上，是一个基因家族，许多基因与其有关，其中DYS1基因为重要的候选成
分[4,5]，并已发现部分无精子症或严重少精子症的患者基因组DNA中有DYS1的丢失[5]。
由于DYS1片段较小，其丢失在常规的染色体核型分析中不易发现，往往难以诊断。
PCR方法的发展为这一基因片段的检测创造了条件。本研究应用PCR法检测严重少精子
症或无精子症男子基因组DNA中的DYS1基因，获得了较为满意的结果，现报道如下。
材料和方法
1.病例选择
130例男性不育患者均来自不育专科门诊，根据WHO的标准，连续3次精液常规分
析，均确诊为无精子症或严重少精子症。其中无明确病因的无精子症患者95例，严重
少精子症患者35例，常规染色体核型分析均为正常(46，XY)。正常对照为50例已生育
男子，精子数＞6 000万/ml。
2.实验方法
2.1 模板DNA的提取：抽取患者静脉血1ml，抗凝，分离白细胞，经蛋白酶K处理，
常规盐析法提取DNA。
2.2 寡核苷酸引物：寡核苷酸引物采用DYS1和ZFX/Y两对，DYS1扩增采用Vollrath
等[4]人设计的引物，为：
5′-TGTCACACTGCCCTAATCCT-3′和
5′-TGGTCATGACAAAAGACGAA-3′，
扩增产物为132bp。ZFX/Y能扩增人X和Y染色体的部分序列，采用Asen[6]于1990年设计
的引物，为:
5′-ATAA TCACATGGAGAGCCACAAGCT-3′和
5′-GCACTTCTTTGGTATCTGAGAAAGT-3′，
扩增产物为445bp，在本实验中作为阳性对照。(以上引物均由英国Glasgow大学的
O′Shaughnessy P J教授馈赠)
2.3 多聚酶链式反应(PCR)：反应总体积为30μl(50mmol/L KCl, 3mmol/L MgCl2,
10mmol/L Tris-HCl, pH8.3,0.5U Taq DNA多聚酶，200nmol/L引物×2，40μmol/L
dNTPs，石蜡油封盖后，96.6℃变性3min。PCR反应条件为96℃变性30s，55℃退火75s，
73℃延伸60s，反应共30个循环。
2.4 扩增产物的电泳：取扩增产物15μl，加入含溴酚蓝的载样缓冲液3μl，充分混
匀后点样于1.2%琼脂糖凝胶(内含1%的溴化乙锭)，30V，电泳1h，紫外灯下观察扩增条
带。
结 果
电泳结果显示，正常有生育能力男子(精子数＞6 000万/ml)均可见ZFX/Y和DYS1扩
增片段。95例无精子症患者中，4例仅见ZFX/Y扩增片段，示DYS1基因的丢失或突变(附
图)。35例严重少精子症男子中，也发现3例患者有DYS1基因的丢失。
附图 电泳示正常男子(a)和部分患者(b-k)DYS1基因PCR扩增产物，其中i号患者有DYS1
的丢失
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