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体外培养兔角膜内皮细胞电生理特性的初步研究

。目前的研究方法有微电极法、 放射性检验、电压敏感性染色及膜片钳技术[8,12-14],其中以膜片钳技术应用最为普遍。由于角膜内皮细胞非选择性阳离子通道的存在[11],离子通过该通道仅需电压驱动,当阻断通过此通道的电流并将细胞的电流钳制在0 mA后,所测定的电压值即为膜电位[13]。

    本实验获得的RCECs膜静息电位绝对值小于钾离子的平衡电位(-90 mV)的绝对值,可能由于细胞膜上存在其他离子通道,改变了膜电导。此外,生电性转运体的(如钠泵)活性和细胞的输入阻抗也会影响细胞的静息膜电位。研究发现阴离子激活的钾通道在生理状态下仅部分开放,形成细胞的输入电导。角膜的透明性与角膜内皮细胞的静息电位密切相关,主要与K+通道有关。当K+再循环通路受阻,导致水肿发生。研究已证实编码通道Kir3.3[11]及Kir2.1[9]的氨基酸序列,后者表达产生内向整流的钾离子电流,可被外源性Ba2+和Cs+阻断,并呈现电压和浓度依赖性,该通道与角膜内皮细胞的膜电位调节、内皮细胞的跨膜转运等功能有关[15-16]。

    全细胞模式下记录的全细胞电流系宏观电流,包含了多种离子通道的综合作用,电流包含各通道的成分。通过改变实验条件,可以分离各种通道电流,如控制灌流液的温度、特定的刺激程序以及特异性的工具药在一定的实验条件时,可将另外一种或几种通道电流阻断,从而得到单一通道的电流。本研究中所记录的全细胞电流以外向电流为主,可能主要是A电流和K+通道电流。实验中所记录到的内向电流可能由阴离子选择性K+通道、Na+通道、Ca2+通道等共同形成。本实验中原代细胞较第2代细胞的全细胞电流大,提示原代培养的RCECs电生理特性更接近活体细胞状态。在本研究记录过程中发现的电流变异,可能与细胞状态有关。出现的快相、短时程的的微小内向电流可能与生电钠泵或A电流相关。具有电压及时间依赖性的外向电流应当为K+通道开放所致。状态良好的RCECs可观察到完整的全细胞电流。

    本研究成功建立了体外培养RCECs全细胞模式记录方法,是对角膜内皮电生理学方面的初步探索。相信在此基础上,会推动角膜内皮细胞的电生理功能研究向纵深发展。

【参考文献】
  [1] 邢咏新,张林. 刀豆蛋白A条件化培养基对体外培养兔角膜内皮细胞生长的影响[J]. 西安交通大学学报,2008,29(4):374-378.

[2] 杨鹏,刘瑶,曾水林,等. 兔角膜内皮细胞的新法培养[J]. 东南大学学报(医学版),2001,20(3):170-172.

[3] 张劲松,石树敏. 角膜内皮细胞培养的实验研究—培养的家兔角膜内皮细胞的形态学初步观察[J]. 实用眼科杂志,1990,8(5):271-272.

[4] Neher E, Sakamann B. Single channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibers[J]. Nature,1976,260(5554):799-802.

[5] Rae JL, Dewey J, Cooper K, et al. Potassium channel in rabbit corneal endothelium activated by external anions[J]. J Membr Biol,1990,114(1):29-36.

[6] Rae JL, Dewey J, Cooper K, et al. A non-selective cation channel in rabbit corneal endothelium activated by internal calcium and inhibited by internal ATP[J]. Exp Eye Res,1990,50(4):373-384.

[7] Mergler S, Dannowski H, Bednarz J, et al. Calcium influx induced by activation of receptor tyrosine kinases in SV40-transfected human corneal endothelial cells[J]. Exp Eye Res,2003,7

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