形，传代后第3~5天为细胞生长旺盛期，随细胞数增加，细胞逐渐呈典型的角膜内皮细胞多角形形态，细胞单层生长，胞浆丰富，核仁明显，细胞连接开始形成。传代细胞生长至第7天可达到融合状态（见图1-C）。 2.２ RCECs电生理参数记录结果 体外培养原代RCECs与第2代RCECs平均静息膜电位水平差异有非常显著的统计学意义（P<0.01），见表1、图2。钳制电位为+60 mV时，原代RCECs的全细胞电流明显大于第2代（P<0.01），见表1、图3。
本实验中，在相同记录条件下，所记录电流变异较大。巨阻封接细胞后，2个细胞（2/5）出现一个快相、短时程的方向向下的微小内向电流，而后变为外向电流，并随电压逐渐增大，并呈时间依赖性。3个细胞（3/5）仅可见外向电流，超极化下未见明显的内向电流。状态良好的RCECs可观察到完整的全细胞电流。
3 讨论
3.1 RCECs原代及传代培养 本实验采用揭取后弹力层及角膜内皮细胞层法结合组织块法成功实现RCECs的原代培养
[2-3]。使用本研究小组既往实验中作为细胞生长佐剂的刀豆蛋白A（concanavalin A， Con A）的条件化培养基，促进细胞生长。 实验结果显示，原代RCECs在组织块贴壁72 h后即可自组织块边缘迁出，呈多角形、卵石样排列。本实验中选用生长5~7 d原代RCECs进行实验操作，细胞生长10 d左右，汇合率达80％以上时进行传代。第2代RCECs细胞呈多角形、卵石状，传代细胞在5~7 d时即形成单层细胞，此时细胞活性最佳，可进行实验操作。
3.2 体外培养RCECs电生理特性研究 Neher等［4］于1976年建立了膜片钳技术（patch clamp recording technique）。该技术以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜上单一的(或多个的)离子通道活动。以后由于吉欧姆阻抗封接（gigaohm seal，109 Ω）方法的确立，使其测量电流分辨率可达到1 pA，其电极尖端直径仅有几个微米，故对于体积较小、脆性较大的细胞亦可进行电压钳制，从而可用于多种细胞的研究。膜片钳技术的出现迅速将生命科学研究推进到细胞和分子水平。
国外学者利用此技术对角膜内皮细胞做了大量研究工作，在角膜内皮细胞的电生理特性、生物学意义方面取得了一定的研究进展。
研究发现角膜内皮细胞上存在多种离子通道，如Na＋通道、K＋选择性离子通道、非选择性阳离子通道、Ca2＋通道等［5-7］，其中K＋离子通道与静息电位关系最为密切。有研究表明，兔角膜内皮细胞上存在着一种温度敏感性的K＋离子通道，温度升高可增加其电导，被认为是角膜内皮细胞静息电位的主要来源[8]。在内皮细胞的K＋离子通道中的Kir2.1 mRNA序列对于细胞静息电位的维持具有重要作用［9］。Watsky等［10］利用传统全细胞膜片钳和穿孔性膜片钳技术分别检测新鲜分离的兔角膜内皮细胞的离子电流，记录到一种与可兴奋细胞的A电流类似的电流，呈现外向性、整流性、非选择性K＋离子瞬时电流。这一电流可被奎尼丁和4-氨基吡啶以剂量依赖性方式阻断，同时引起角膜内皮和基质的水肿，编码K＋离子通道kv3.3的氨基酸序列是产生A电流样电流的结构基础，研究证实这一通道对于内皮细胞及基质的容量调控具有重要作用［9］。
Mergler等[7]的研究首次证实L型Ca2＋通道与成纤维细胞生长因子受体酪氨酸激酶的关联，对于研究活体及培养的人角膜内皮细胞的功能具有重要价值。而Rae等［11］利用两性霉素B穿孔性膜片钳技术对机械及热损伤的兔角膜内皮细胞的研究中发现，在损伤的角膜内皮细胞中，正常状态下的K＋通道电流消失，而表现为一种非选择性的阳离子电流。这一损伤诱导的通道电流是一种外向性整流性电流，在细胞膜去极化时具有活性，可被奎尼丁、氟灭酸及醋酸盐抑制。正常状态下的内皮细胞则不表现这一特征电流。本实验发现原代RCECs较第2代细胞更接近在体状态，细胞活性状态最佳，易于封接。
角膜内皮细胞的膜电位是反映细胞膜上离子传导性的纯粹数值
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