体外培养兔角膜内皮细胞电生理特性的初步研究

【摘要】  目的 通过测定体外培养兔角膜内皮细胞（rabbit corneal endothelial cells，RCECs）静息电位及全细胞电流，初步研究角膜内皮细胞的电生理特性。方法 采用后弹力层及内皮层揭取联合组织块法进行RCECs体外培养，采用膜片钳全细胞记录模式记录原代及传代RCECs细胞静息电位及全细胞电流，绘制电流—电压（I/V）曲线。结果 体外培养原代RCECs的平均静息膜电位水平为（20.9±1.7）mV（n=6），第2代RCECs的平均静息膜电位水平为（15.1±1.8）mV（n=6），两者差异有统计学意义（P<0.01）。在钳制电位+60 mV下，原代RCECs全细胞电流为（396.2±39.0）pA（n=5)，大于第2代RCECs的全细胞电流（201.4±45.2）pA（n=5)，差异有非常显著的统计学意义（P<0.01）。结论 后弹力层及内皮层揭取联合组织块法获得的原代及传代RCECs，在静息电位和全细胞电流等电生理特性方面存在差异。

【关键词】  角膜内皮细胞；细胞培养；膜片钳；细胞电生理

角膜的透明性是维持视觉器官正常生理功能的重要条件。角膜内皮细胞层是维持角膜透明性的重要结构。由角膜内皮细胞病变引起的致盲性眼病已经成为危害人们尤其是老年患者的重要致盲眼病之一。角膜内皮细胞体外培养及人工角膜构建技术的日臻完善，为供体短缺的角膜移植手术带来了希望。

    随着膜片钳技术的广泛应用，国外许多学者已将该细胞电生理研究技术应用于角膜内皮细胞的生理、病理以及药物疗效评价等方面，取得了较大的进展。国外的研究结果表明角膜内皮细胞中存在许多不同类型的离子通道，这些离子通道对维持角膜内皮细胞的泵功能及角膜透明性具有重要作用。而国内对于角膜内皮细胞电生理特性的实验研究少见报道。本研究采用膜片钳全细胞记录模式对体外培养兔角膜内皮细胞的静息电位及离子电流进行测定，初步探索角膜内皮细胞电生理研究方法。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  实验动物  健康成年新西兰白兔，雌雄不限，体重为1.5～2.0 kg，由西安交通大学医学院动物中心提供。

    1.1.2  主要仪器设备  CO2培养箱3111（FORMA公司），倒置相差显微镜DMIRBHC（Leica公司），医用超净化工作台SWCJIF（苏州安泰空气技术公司），高速离心机（北京医用离心机厂）。Axon 200B膜片钳放大器（Axon公司），Axon 1200型D/A－A/D转换器（Axon公司），PP-83垂直微电极拉制仪（Narishige公司），Leitz DM 1 L倒置显微镜（Leica公司），M0-103型微操纵仪（Narishige公司），HY-8020型A/D转换器（北京华远计算机公司），计算机为Pentium Ⅱ(266MHz)兼容机，有芯玻璃微电极（外径1.4 mm，南京泉水教学实验器材厂），防震台（上海亿奥公司）。

    1.1.3  主要试剂及溶液  RPMI1640培养基（GIBCO公司），胎牛血清（杭州四季青生物制品公司），2.5%胰蛋白酶（GIBCO公司），L-谷氨酰胺（SIGMA公司）2 mM/L，ConA条件化上清液（由第四军医大学空医系细胞培养室提供）。条件化培养基：每100 ml RPMI1640培养基中分别加入10 ml ConA条件化上清液，10 ml胎牛血清，1 ml L-谷氨酰胺，100 U/ml青霉素，100 μg/ml链霉素。庆大霉素（天津华津制药厂），葡萄糖酸钾（K-Gluconate，Sigma公司），EGTA（上海华美医药试剂公司），HEPES（上海华美医药试剂公司）。标准电极内液：K-Glucose 140 mM，MgCl2 2 mM，EGTA 3 mM，HEPES 10 mM，以1 M KOH调整为pH＝7.4。标准细胞外液：NaCl 150 mM，KCl 5 mM，MgCl2 1 mM，CaCl2 3 mM，Glucose 10 mM，HEPES 10 mM，以1 M NaOH调整为pH＝7.4。