> 1.2 兔角膜内皮细胞（rabbit corneal endothelial cells，RCECs）体外原代培养 采用揭取后弹力层及角膜内皮细胞层联合组织块法进行兔角膜内皮细胞体外原代培养。乙醚吸入麻醉后，摘取兔眼，去除眼球附属组织，以4×104 U/L的无菌生理盐水冲洗浸泡眼球30 min。在超净工作台内，将眼球置于无菌培养皿的D-Hanks液中，在立体视解剖显微镜下，于角膜缘内1 mm 360°环形剪取角膜片（corneal button），内皮面向上，沿角膜片边缘揭取内皮细胞层，并切割成1 mm×2 mm大小的组织块，内皮面向下置于0.1％明胶及胎牛血清预处理的无菌培养瓶中，铺平展开组织块。于37°C、5％ CO2培养箱中孵育、贴壁4 h后，加入条件化培养基，置于培养箱中继续孵育。72 h后首次更换培养液，以后每3天换液1次。 1.3 RCECs传代培养 细胞生长接近融合期或局部密度较大时进行传代。倾去原培养液，以D-Hanks液清洗。加入0.25％胰蛋白酶1 ml，于37°C、5％ CO2培养箱中消化3~5 min。在倒置显微镜下观察见细胞胞体回缩、变圆，即加入含10％胎牛血清的RPMI1640培养基终止消化。吸管适度轻轻吹打至细胞脱落，将细胞悬液移至5 ml离心管中，1500 r/min离心5 min，弃上清液，注入新鲜培养液，重悬细胞，按8×104～1×105个/L密度接种于培养瓶中，置于37°C、5％ CO2培养箱中继续孵育，按常规换液，待细胞融合，同法传代。
原代及第2代RCECs通过神经烯醇化酶（neurone-specific enolase，NSE）染色进行鉴定，证明其神经嵴来源，具体方法参考本课题组既往研究结果[1]。
1.4 RCECs电生理研究
1.4.1 细胞准备 取原代及第2代RCECs，消化后置于细胞记录槽中贴壁2 h，以重力法灌流细胞浴池液3~5 min，更换原培养液。在倒置相差显微镜下观察细胞形态，选择活性较好的细胞作为记录细胞，即：细胞折光性好、立体感强，细胞膜干净光滑完整、胞质均匀、细胞富有光泽。以100% O2气体（2 ml/min）持续灌流记录槽内细胞。
1.4.2 RCECs静息电位及全细胞电流测定 实验当日取外径1.4 mm、内径0.8 mm的毛细玻璃毛坯，采用两步法拉制电极，尖端直径1~2 μm，电极电阻3~5 MΩ。充灌电极内液，室温（25℃）下，采用全细胞模式进行记录。注射器负压吸引，达GΩ巨阻封接。脉冲式负压或ZAP破膜，形成全细胞记录状态。在电流钳状态下，给予0 nA钳制，记录细胞静息膜电位（resting membrane potential，RMP）。然后转换至电压钳状态，钳制电位-20 mV，阶跃电压为20 mV去极化，-120～+100 mV，脉冲时间250 ms，间隔时间1 s，5 Hz低通滤波，记录全细胞膜电流变化。测得全细胞电流均经电流—电压转换。采用Microcal公司Origin ６.０绘图软件做图。取每一刺激过程最后400 ms的电流均值进行Clampfit 8.0统计处理。n为检测的细胞数。
1.5 统计学方法 采样软件使用Clampex 8.0软件，数据分析及绘图采用Clampfit 8.0及Origin 6.0软件。统计学方法采用SPSS 13.0 One-way ANOVA。2 结果
2.１ 成功实现RCECs体外原代及传代培养 原代RCECs培养72 h后，即可见内皮细胞自组织块边缘迁出，细胞呈多角形，近组织块部位细胞呈现典型内皮细胞多角形形态，鹅卵石样或不规则形（见图1-A）；原代生长7 d左右，细胞生长最旺盛，形成以组织块为中心的生长密集区，细胞呈多角形、圆形或鹅卵石状，可见细胞间汇合，呈单层片状（见图1-B）；细胞生长至10 d左右，细胞汇合率约为80％，接近融合期时进行传代培养。
传代后RCECs 24 h贴壁，呈多角形、类圆形或圆
上一页 [1] [2] [3] [4] [5] 下一页
您现在的位置： 绿色健康网 >> 医学论文 >> 五官科论文 >> 正文