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抗人肝癌免疫毫微粒的制备及体外免疫学性质的鉴定 |
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将化疗药物吸附、包裹或夹嵌在白蛋白等生物可降解材料中制成毫微粒(N anop articles，NP)，应用于肿瘤治疗是目前药剂学中研究热点［1，2］。毫微粒具有载 药 量大、缓释药物、药物无需化学偶联而以游离形式被包封等多重优点，此外它具有靶向给药 特性，即能将药物选择性浓集于病变部位，而不分布或少分布在其它正常部位［1，3 ］。然而毫微粒的这种靶向给药是器官被动靶向，无主动靶向结合癌细胞作用，因此毫微 粒释药杀伤癌细胞同时，不可避免对正常组织造成损伤［4］。将肿瘤特异性抗体吸 附或交联到载药毫微粒上，制备抗体导向的毫微粒即免疫毫微粒(Immunonanoparticles)，将具 有载药量大、缓释药 物、主动靶向性抗癌作用等多种特性，是一种新型的肿瘤导向治疗制剂 ［4-6］。我们将抗人肝癌单克隆抗体HAb18与载米托蒽醌(Mitoxantrone,DHAQ)的 牛血清白蛋白毫微粒(DHAQ-BSA-NP)共价交联，构建了人肝癌特异的免疫毫微粒(HAb18-D HA Q-BSA-NP)。本文报道了此免疫毫微粒的制备、体外免疫学结合特性及其选择性抗瘤作用 。
1 材料与方法
1.1 DHAQ-BSA-NP冻干品 本校药学院张志荣教授惠赠，批号981216，4 ℃保存备用。
1.2 抗体 抗人肝癌单克隆抗体HAb18由第四军医大学病理教研室陈志南教 授惠赠。抗人SIgA单抗4E3纯品由本室自制，本研究中用作对照抗体。免抗小鼠IgG抗血清， FITC标记羊抗小鼠IgG抗体均为华美生物工程公司产品。
1.3 主要试剂 异型双功能交联剂SPDP为CAL Biochem公司产品，用无水乙 醇配成浓度20 mmol/L；DTT为Serva公司产品； 3H-TdR为中科院上海原子核研究所 产品。
1.4 细胞株 人肝癌株SMMC-7721，本室保种传代；人胃癌株SGC-7901，本校陈曼玲教授惠赠。
1.5 单抗与毫微粒的交联 参照文献［4，7］方法加以改进。10 mg单抗经0.05 mol/L,pH7.5的PBS透析，加入SPDP 10 μl，于室温下搅拌30 min，过G-25 柱，用PBS洗脱，首峰即为纯化Ab-PDP，取毫微粒30 mg，超声匀化，同前加入SPDP，搅拌3 0 min,用0.05 mol/L pH4.5的醋酸缓冲 液离心洗涤以去除剩余SPDP，将沉淀(NP-PDP)分散于醋酸缓冲液，加入DTT(终浓度25 mmol /L)，室温搅拌30 min，以还原NP-PDP，用PBS离心洗涤去除剩余DTT，得NP-PDP-SH。将A b-PDP和NP-PDP-SH混合，室温振荡20 h，用PBS离心洗涤数次，沉淀即为免疫毫微粒。
1.6 免疫毫微粒的鉴定 玻片凝集试验，免疫荧光法均参照文献［5］方法进行。
1.7 花环形成实验及花环形成阻断实验［8］ 取SMMC-7721细胞悬液与不同浓度HAb18抗体混合 ，4℃作用30 min，用PBS离心洗涤细胞，加入HAb18-DHAQ-BSA-NP，室温振荡30 min，计算花环形成率。
1.8 扫描电镜观察 参照文献［5］方法进行。
1.9 免疫毫微粒与细胞结合的免疫荧光染色 同1.6制 备荧光免疫毫微粒(Fluorescent immunonano-particles)。在细胞悬液中加入等体 积荧光免疫毫微粒，4℃孵育30 min，PBS离心洗涤，荧光显微镜观察。
图1 免疫毫微粒HAb18-DHAQ-BSA-NP的玻片凝集反应
Fig.1 Direct agglutination of immunonanoparticles (HAb18-DHAQ-BSA -NP)
in the presence of rabbit anti-mouse IgG
1.10 荧光染色阻断实验 取SMMC-7721细胞悬液与不同浓度HAb18抗体 混合，4℃作用30 min，洗涤，加入荧光免疫毫微粒(HAb18-DHAQ-BSA-NP)，后续步骤同1.6。
1.11 免疫毫微粒的细胞毒试验 采用 3H-TdR掺入法，参照文献 ［5］方法进行。洗去游离毫微粒后，继续培养细胞4 d。
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