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广西肝癌患者乙型肝炎病毒前C区基因的突变 |
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without HBeAg.
Key words Hepatitis B virus;Genes;Mutation;Liver neoplasms
广西是全球原发性肝癌高发区，90%以上病例的血清HBsAg阳性［1］,HBsAg阳性者的HBeAg又常为阴性。此外，不少乙型肝炎病毒（HBV）携带者虽然HBeAg阴性，但HBV DNA仍为阳性，提示HBV变异株的出现可逃避宿主的免疫清除，从而引起慢性感染［2］。目前的研究认为，HBV变异株的产生与前C区的突变有关，1 896 位核苷酸由G→A，导致第28位密码子突变为终止密码，从而阻断HBeAg的合成。作者报道16例广西原发性肝癌患者血清HBV DNA前C区扩增及测序结果，以探讨与HBeAg阴性的原发性肝癌患者HBV感染的关系。
对象与方法
1.研究对象:血清采自南宁市各大医院经病理确诊为原发性肝癌的16例患者,其中男性10例,女性6例,除1例为HBeAg阳性外，其余13例均为HBeAg阴性。
2.试剂:PCR试剂购自Promega公司;载体及感受态细胞购自Invitrogen公司;克隆DNA的提取试剂盒QIAspin prep 购自Qiagen公司;测序反应试剂盒购自Buckinghamshire公司。
3.研究方法:
(1)取10 μl血清加90 u磷酸盐缓冲液,煮沸15 min,13 000 r/min离心。取上清10 μl套式PCR,反应体积为50 μl。每份标本平行做2个PCR。第1轮扩增引物为B935(nt1 240～1 260 5′-GCG- CTGCAGAAGGTTTGTGGCTCCTCTG-3′) 和MDC1(nt 2 304～2 324 5′- TTGATAAGATAGGGGCATTTG- 3′)，反应条件为94℃变性1.5 min、50℃退火45 s、72 ℃延伸4 min,30个循环后继续循环（72℃ 10 min，22℃ 5 min）；第2轮扩增引物:XSEQ1(nt1 547～1 564 5′-CCCCGTCTGTGCCTTCTCATCTG-3′)和HDB2(nt2 134～2 152 5′-GCGAAGCTTAGATCTCTGGATGCTGG
A-3′)，反应条件：94℃变性45 s、50℃退火45 s、72 ℃延伸2 min,30个循环后继续上述循环。
(2)载体的连接及克隆的筛选：取第2轮扩增产物2 μl连接到PCR2.1载体,在4℃下过夜,次日转染感受态细胞,第3日挑选克隆并培养过夜,第4日用EcoR1酶消化，筛选阳性克隆,阳性克隆的剩余培养液提取DNA用于测序。每份标本取3个克隆。
(3)测序：5 μl纯化的DNA在1 μl NaOH和2 μl引物XSEQ3(nt 1 653～1 6725′-CATAAGAGGACT- CTTGGACT- 3′)中变性40 min,随后在2 μl测序酶缓冲液,1 μl HCl及1 μl Tris.HCl溶液中和25 min,测序反应按试剂盒说明书进行,测序酶为2.0版,同位素用35S。测序反应混合物在变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳（80 V,3.5 h),用10%醋酸固定凝胶后,在80℃真空下烘干胶块,与X光片一起放入暗盒,次日洗片。
结果
1.套式PCR结果:14例HBV DNA阳性,阳性率为87.5%。
2.测序结果:由图1可见，病例23、24为正常序列；病例7、14为野毒株和突变株混合感染；其余的标本为单独突变株感染。仅病例4、5、12第28密码子为终止密码, 病例8为有终止密码和无终止密码变异株混合感染。病例2、3、10、11、15的nt 1 858位由T→C；病例2、10、15的1 856位由C→T。病例8和病例13在nt 1 838位由A→G，从而导致异亮氨酸→缬氨酸；病例11的nt 1 850位由T→A，使该密码由丝氨酸变为苏氨酸；病例7的nt1 889位由T→C,由色氨酸变为精氨酸。此外, 病例3、5、11、14的nt1 846位由A→T，病例8的1 877位由C→T，病例3的1 879位G→A，均为无义突变。
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