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端粒酶活性与慢性粒细胞白血病病程关系的研究 |
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myeloid, chronic
端粒（telomere）和端粒酶（telomerase）是近来生命科学研究的热点之一。正常细胞每分裂一次，端粒会缩短一些，直至危机点，触发停止细胞分裂信号，细胞将走向衰老和死亡，少数细胞若逃脱危机点，激活端粒酶，进而永生化和恶变，因而研究端粒和端粒酶系统对阐明细胞衰老和恶变的机制，对抗衰老和临床上肿瘤的诊断和治疗有着重要的意义。慢性粒细胞白血病（chronic myelocytic leukemia,CML）为一种多能造血干细胞恶性增生疾病，临床上可分为慢性期、加速期和急变期。本文采用聚合酶链反应-酶标记免疫吸附分析法(PCR-ELISA)对CML各期的患者骨髓单个核细胞端粒酶活性进行检测，以研究端粒酶活性水平与CML病程的关系。
材 料 和 方 法
一、材料
人白血病细胞系K562、J6-1为本教研室肿瘤生化室传代培养。
二、标本
由医院确诊的CML患者40例，其中慢性期患者15例，加速期患者9例，急变期患者10例，CML慢性期治疗后6例，诊断标准符合1989年第二届全国白血病学术会议制定的分期标准，另有10例为正常骨髓标本。
三、端粒酶活性测定
端粒酶PCR-ELISA试剂盒(德国宝灵曼公司)。
（一）标本制备 细胞系J6-1，K562传代细胞取2×106细胞，4℃ 3 000 r/min离心10 min，弃去上清液，PBS洗两遍，4℃ 3 000 r/min离心10 min，留沉降细胞。
待测标本，骨髓2 mL经肝素抗凝后，淋巴细胞分离液分离，取2×106细胞，PBS洗两遍，4℃ 3 000 r/min 10 min，留沉降细胞。
(二)端粒酶的提取 取2×106细胞，加200 μL裂解液，冰浴中30 min,4℃ 16 000 r/min 20 min，留上清液。
(三)PCR扩增 取25 μL反应混合液，加3 μL细胞提取液，加双蒸水至50 μL。25℃反应30 min，94℃灭活5 min进入PCR循环：94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 90 s共30个循环，72℃延伸10 min，终止反应。
(四)ELISA 扩增产物5 μL加20 μL变性液混匀后，室温放置10 min； 加入225 μL杂交液混匀后，取100 μL加入亲和素包被的反应孔中37℃振荡2 h，弃去液体，清洗液250 μL洗3次； 加100 μL过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，37℃反应30 min弃去液体，清洗液洗2次； 加入100 μL TMB显色液室温20 min； 加入100 μL终止液终止反应，静置20 min； 酶标仪测定450 nm和690 nm波长下的吸光度。
(五)对照 阳性对照，试剂盒提供的293细胞株裂解上清液。 阴性对照，K562细胞株裂解上清液经65℃灭活10 min。
（六）计算与统计 以450 nm与690 nm的吸光度差值表示其端粒酶活性，并以样品测量值与试剂盒的阳性对照测量值的百分比作为其活性相对值。对各组数据（±s）进行方差分析及q检验。
结 果
一、 白血病细胞系J6-1，K562有较强的端粒酶活性，见表1。
表1 白血病细胞系的端粒酶活性
Tab 1 Telomerase activity of normal bone marrow,
J6-1 and K562(±s,n=10)
Group Telomerase activity
Ⅰ(normal bone marrow) 9.85±0.68
Ⅱ(J6-1) 110.00±4.10**
Ⅲ(k562) 107.00±2.86**
** P＜0.01， vs group
二、正常骨髓标本10例的端粒酶活性平均值为9.85±0.68，活性微弱。15例CML慢性期均值24.48±12.73，高于正常骨髓对照组（P＜0.05）。9例CML加速期患者端粒酶活性均值为76.76±21.84，10例CML急变期患者端粒酶活性平均上一页 [1] [2] [3] 下一页
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