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ATP活化的小鼠巨噬细胞通讯功能的研究 |
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es was observed in ATP-stimulated Mφ cells.(5) The ATP-stimulated Mφ cells displayed reorganization of F-actin from dot-like structure of controlled group to well-assembled filamentous stress fibre structure. Conclusion These results indicated that activative Mφ cells by ATP stimulation was correlated closely with GJIC, CX43 expression and cytoskeleton reorganization.
【Key words】 ATP; Macrophages cells; Activated; GJIC; CX43; Vinculin; F-actin
活化的巨噬细胞(Mφ)在机体免疫体系中发挥着重要作用［1］，研究Mφ的活化，对了解其生理功能和提高机体的免疫水平都有重要理论意义和应用价值。我们曾报道ATP可促进巨噬细胞吞噬功能［2］，现我们又研究了ATP对Mφ的活化作用，以及连接蛋白CX43表达、间隙连接通讯功能、纽蛋白和微丝蛋白共同参与Mφ活化过程的调节作用。
材料和方法
1.腹腔巨噬细胞(Mφ)的制备
将昆明种小白鼠(18～22g)雌雄不拘，断头处死，由腹腔注射5ml Eagle液，揉搓腹部2min，吸出含Mφ的腹腔液，调整腹腔液的细胞浓度为105／ml，实验组加入0.23g/L ATP，对照组不加ATP，把细胞分别接种于96孔板(每组5个孔，每孔细胞数为10 000)和24 cm的塑料皿内(铺或不铺盖片)，每皿细胞数为1.5×105。经37℃CO2孵育箱15min，待细胞贴壁后用PBS吹打清洗3次，把未贴壁和贴壁不牢的细胞去掉(巨噬细胞粘附作用强，镜检和染核证实，用此法获取纯化的Mφ为90%以上，偶见小淋巴细胞和嗜中性白细胞)，分别进行MTT法检测ATP对Mφ的活化作用，罗氏黄荧光染料示踪实验检测活化的Mφ的通讯功能，免疫荧光方法检测CX43蛋白、纽蛋白的表达，并进行微丝蛋白(F-actin)标记实验。
2.MTT法测定Mφ的活性
把接种于96孔板的两组细胞在37℃温箱内孵育15min后，细胞贴壁，去上清，用PBS用力吹打清洗3次(镜检细胞纯度为90%以上)，每孔(每组5孔)加入20μl MTT(5g/L PBS),在37℃温箱内孵育2h，PBS洗后，每孔加入150μl二甲基亚砜(DMSO)溶解染料结晶后在酶标仪(美国Bio-Rad)540nm波长处测定吸收度A值，进行t检验，求P值。
3.罗氏黄荧光染料示踪技术［3］-细胞间隙连接通讯功能
把两组细胞(24cm培养皿内)贴壁后，去上清，分别经PBS吹打清洗后，再分别加入0.05%PBS+的Lucifer yellow(Ly, Sigma)荧光染料，3min后在荧光显微镜下观察Ly在Mφ的传输情况，代表Mφ的间隙连接通讯功能。(细胞间隙连接通道允许<1 000道尔顿的大分子通过，Ly染料分子量<1 000道尔顿，能通过细胞膜进入细胞，以表示Mφ的间隙连接通讯功能)。
4.连接蛋白CX43的免疫荧光检测
把两组细胞盖片经PBS用力冲洗3次后，经2%甲醛固定3min后，在摇床上用0.5%Triton X-100／PBS洗涤30min(间换3次)，孵育于兔抗CX43抗体(1∶2 000)37℃，1h，0.5% Triton X-100／PBS抽提30min，再与标记异硫氰荧光黄的羊抗兔IgG(Jackson Co)反应1h，5% Triton X-100／PBS洗后，0.9%NaCl洗3次，再用染核的荧光染料(Dapi)复染核，60%甘油封固，Olympus BH-2型荧光显微镜观察。Kadak TMA×400胶片拍照。
5.纽蛋白(vinculin)和微丝(F-actin)蛋白双染技术
两组细胞盖片经过PBS冲洗、固定(同上)，先后经一抗(鼠抗vinculin 1∶50 PBS)和二抗(FITC-羊抗鼠IgG 1∶50 PBS,Jackson)，以0.5%上一页 [1] [2] [3] 下一页
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