|
地塞米松对SUNE |
| |
标记)试剂盒及地塞米松均为Sigma公司产品。2. ［32?P］-dCTP：匹兹堡大学核医学研究所合成，强度为74×104Bq/μL,22.2×104 Bq/pmol。3.RT-PCR试剂盒(一步法)，1 kb DNA ladder, RPMI-1640培养液及胎牛血清(fetal calf serum, FCS)，购于GIBCO公司。4.β-肌动蛋白(β-actin)基因片段，由匹兹堡大学癌症研究所提供。5.RNA抽提、纯化试剂盒(UltraspecTM RNA)：购自Biotecx-laboratories公司。6.细胞株：SUNE-1由中山医科大学肿瘤研究所提供［7］，B95-8［8］及K562由匹兹堡大学癌症研究所提供。
二、方法：
1.按常规方法进行细胞培养、传代。三种肿瘤细胞各取终浓度为5×10-6个／mL，2 mL经台盼蓝染色检查，死细胞小于5%，分成实验组和对照组备用。2.实验组加入终浓度为2×10-6 mol/L地塞米松，对照组则加入等体积的RPMI-1640培养液，继续培养18 h［9］。3.RNA抽提：用UltraspecTM RNA,其提取方法是：①倾去培养液，直接向培养瓶中加入UltraspecTM RNA溶液1 mL，颠倒混匀数次，在4℃放置5 min;②将液体移至新的1.5 mL Eppendorf管中，加入0.2 mL氯仿，振荡混匀后，放置冰上5 min;③4℃，12 000×g 15 min离心；④小心地将4/5上清液移至新的Eppendorf管中，加入等体积的异丙醇，混匀后4℃放置10 min；⑤4℃，12 000×g 10 min离心后，倾去上清液，分别用1 mL 75%的乙醇洗两次，每次先振荡混匀，再在4℃，7500×g 5 min离心；⑥真空干燥10 min,用30～40 μL 0.1%焦磷酸乙二酯(DEPC)水溶解，经紫外分光光度法定量后，-20℃储存备用。4.RNA定量：用紫外分光光度法和电泳法［10］。根据OD260定量：根据OD260／OD280分析其纯度，再根据紫外分光光度法测定的结果，各取5.0 μg进行常规RNA电泳，并在紫外灯下观察、拍摄。5.β-肌动蛋白基因片段和EBV-BHRF1基因片段探针标记及纯化：用缺口翻译法(nick translation)［10］。6.打点杂交(Dotblot)［10］。采用1：2等比释释法，即在5.0 μL的总体积内分别含有RNA样品量是5.0 μg→2.5 μg→1.25 μg→0.625 μg。70℃变性15 min后，将样品加在醋酸纤维膜上，经紫外交联机自动交联后，42℃预杂交2 h，再与β-actin探针在42℃杂交8 h或过夜。经常规(1)在室温下用2×SSC，0.1% SDS溶液100 mL洗2次，各10 min;(2)53℃，用2×SSC，0.1% SDS溶液洗3次，各20 min，用100 mL；(3)53℃，用pH 7.2 Na3PO4，1 mmol/L EDTA，0.1%SDS洗2次，每次15 min；(4)53℃，用pH 7.2 Na3PO4 1 mmol/L EDTA，1%SDS洗2次，每次15 min。洗膜后，在暗房中压片，曝光。若β-actin各组的曝光强度基本一致，再用0.01%×SSC，0.1% SDS经100℃×5 min作用后去除β-actin探针。洗膜后再经上述预杂交2 h后，加入EBV-BHRF1探针，杂交8 h以上。再洗膜。曝光。7.反转录PCR(RT-PCR)一步法检测3种细胞株中BHRF1基因在地塞米松作用前后的表达差异。以β-actin作为内参照。反应条件为：50℃ 30 min→94℃ 2 min→(94 ℃ 30 min， 55℃ 30 min→72℃ 60 min,共25次循环)→72℃ 10 min。取20 μL电泳。
上一页 [1] [2]
上一个医学论文： 内皮素抗体在大鼠肾缺血 再灌注损伤中的作用
下一个医学论文： 低密度脂蛋白对培养的人肾小球系膜细胞的增殖作用及冬虫夏草对其的影响
|
|
|
|
|
|
|
您现在的位置： 绿色健康网 >> 医学论文 >> 基础医学论文 >> 正文