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GDNFR |
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受体孤儿酪氨酸激酶Ret蛋白组成。GDNFR-α含有468个氨基酸，在氨基末端有具分泌作用的信号肽，在羧基末端有23个疏水氨基酸，3个糖基化位点和30个半胱氨酸残基，基局部配布与细胞激动素(cytokine)相似。GDNFR-α通过磷脂酰肌醇附着于细胞质膜外层，与GDNF有高亲合力［5］。为了进一步探讨GDNF对脊髓运动神经元和感觉神经元的生理功能，我们采用免疫组织化学的方法，研究了GDNFR-α在体外培养的大鼠脊髓和背根节神经元中的分布。
材料和方法
1. 材料
1.1 细胞：大鼠脊髓原代细胞和背根节原代细胞，分别取自E14～16d Wistar大鼠脊髓与背根节。
1.2 抗体：纯化的具有高亲合力的羊抗GDNFR-α多克隆抗体，针对大鼠GDNFR-α前体多肽氨基端一段氨基酸残基，购自美国Santa Cruz生物技术公司。SP为ZYMED公司产品，SP工作液试剂盒购自北京中山生物技术公司。
2. 方法
2.1 细胞培养：取40只E14～16d的Wistar大鼠的脊髓和背根节，分别剪切成1mm3后用0.125%的胰蛋白酶(1∶250，Sigma)消化，制成细胞悬液并经20μm孔径的滤膜过滤去除组织碎块，以1×106细胞密度接种在6孔板前2孔内，于37℃、5%CO2孵箱中进行原代培养。培养基为DMEM(Gibco/BRL)，含15%的胎牛血清(天津川页生化制品有限公司)。2d后更换培养液。
2.2 GDNFR-α免疫组织化学染色：细胞培养5d后，第1孔细胞经4%多聚甲醛固定30min；3%H2O2室温孵育20min；5%正常羊血清室温孵育20min；1∶500 GDNFR-α的一抗室温过夜；生物素标记的二抗工作液37℃,30min；辣根过氧化物酶标记的链卵白素工作液37℃，30min；DAB呈色，以上各步之间均用0.01mol/L的PBS冲洗5min×3次。第2孔细胞做正常羊血清阴性对照。
结果
细胞培养5d后，脊髓神经元和背根节神经元均生长良好。脊髓神经元中运动神经元胞体多呈三角形或多角形，从胞体发出数条突起向四周延伸；另一部分神经元个体稍小，多呈椭圆形，突起较小，可能为中间神经元或背角神经元。背根节神经元个体较脊髓神经元稍小，胞体则多呈椭圆形或圆形，从胞体发出1条或2条细长的突起。原代培养的脊髓和背根节细胞中均可见个体较大的胶质细胞，多呈梭形，胞核较大，位于细胞中央。
培养细胞行GDNFR-α抗体免疫组织化学染色后，可见部分脊髓运动神经元(图1)和背根节神经元(图2)呈免疫反应性，免疫反应性的神经元分别占脊髓神经元的30%和背根节神经元的20%。GDNFR-α样免疫反应物质呈棕褐色，分布于脊髓和背根节神经元的胞体和突起上。高倍镜下，可见免疫反应性神经元的胞膜染色较深，未见胞核呈现免疫反应(图1b，2b)。在培养的脊髓和背根节细胞中，偶见胶质细胞呈免疫反应性(图3，4)，胞膜深染，未见胞核染色。
正常羊血清对照组GDNFR-α免疫组织化学染色结果均为阴性。
讨论
神经营养因子(neurotrophic factors,NTFs)是一类对中枢和外周神经系统均有营养活性的蛋白质，具有促进神经系统发育、保护并修复受损神经元、以及促进生长和增进认知记忆过程中神经元之间的连结等功能。GDNF作为神经营养因子家族的新成员，发挥着多效能的神经营养作用，不仅特异地作用于多巴胺能神经元，而且对运动神经元和感觉神经元的发育、存活和再生发挥着重大作用［1～4］。GDNF的受体为多成分的复合物，是由固定于质膜外层的糖基磷脂酰肌醇(GPI)被称为GDNFR-α和GDNF功能性受体孤儿酪氨酸激酶Ret蛋白质组成。GDNFR-α为其配体结合亚单位，而Ret则是GDNF的功能性受体亚单位，即GDNF特异地结合于其受体的GDNFR-α上，再激活Ret的酪氨酸磷酸化传导信号，发挥其生物学效应。GDNFR-α是与GDNF具有高亲合力的细胞表面蛋白质，通过磷脂酰肌醇附着于细胞质膜外层。用125I-GDNF和仓鼠卵巢细胞表达GDNFR-α的实验证明两者的交联和结合是特异的和可逆的。在培养的卵巢细胞或神经细胞用磷脂酶C(PI-PLC)裂解GPI之后，卵巢细胞或神经细胞均失去了对GDNF应答的能力，表明GDNFR-&al上一页 [1] [2] [3] 下一页
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