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纤维蛋白原基因启动子区Hae 多态性和血浆纤维蛋白原浓度与冠心病的相关性研究 |
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HaeⅢ polymorphism fibrinogen
冠心病（CHD）患者体内存在凝血和纤溶失衡，主要表现凝血功能过强及纤溶系统活性降低，导致冠状动脉内血栓形成。大量实验研究及流行病学资料均显示血浆纤维蛋白原浓度升高是CHD发病的一个独立危险因素,而且与纤维蛋白原基因改变有一定关系［1-3］。本研究旨在探讨国人β纤维蛋白原基因启动子区HaeⅢ多态性和血浆纤维蛋白原浓度与CHD的关系，对CHD血栓形成的分子生物学机制作初步探讨。
资料与方法
1.对象选择：自1996年3月至1996年12月间在本院住院的CHD患者随机入选66例，年龄30～69岁，平均年龄（49.7±9.7）岁,男55例，女11例。均符合WHO冠心病诊断标准,并经选择性冠状动脉造影确诊,其中心绞痛23例,陈旧性心肌梗塞43例，有CHD阳性家族史37例(56.1%)。患者直系亲属中凡具备下列条件之一者为家族史阳性：（1）心肌梗塞；（2）脑血栓；（3）未提供明确诊断，但有偏瘫证据者。正常对照组53例，年龄33～64岁，平均年龄（49.1±7.6）岁，男31例,女22例,有阳性家族史11例（20.8%）,均为本院健康职工及家属。
2.β HaeⅢ多态性分析及血浆纤维蛋白原浓度测定方法:早晨空腹,肘静脉采血,分别用3.8%枸橼酸钠及2%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA）抗凝(V/V,9∶1),枸橼酸钠血浆标本用于纤维蛋白原浓度测定(Follin酚法,凝血酶由天津血液病研究所提供)。EDTA抗凝血分离白细胞,用酚、氯仿抽提方法提取人基因组DNA，采用多聚酶链式反应(PCR)扩增目的基因片段,主要参照Thomas等［2］方法。一对上下游引物序列分别为：5′-GGAATGCAATCTCTGCTACCT-3′,5′-TGTCGT-TGACACCTTGGGAC-3′。PCR循环参数94℃预变性90秒,继之进入30轮循环——93℃变性30秒,61℃退火30秒,72℃延伸90秒,扩增目的基因片段长度约1.3kb(图1)。取30μlPCR产物,加HaeⅢ限制性内切酶10～20单位,37℃水浴消化2～4小时,最后放入2%琼脂糖凝胶电泳，置超紫外灯下显影，获得三种基因型：（1）H1H1，指在-453碱基（bp）处无HaeⅢ酶切位点缺失的纯合基因型，将1.3千碱基（kb）长的目的基因片段切成三条带：575bp、383bp、343bp。（2）H2H2指在-453bp处存在HaeⅢ酶切位点缺失，故用HaeⅢ内切酶切不开，呈现两条带型：958bp、343bp。（3）H1H2指两个等位基因其中一个在-453bp处无酶切位点缺失，另一个有酶切位点缺失，为杂合基因型，酶切后呈现四条带型：958bp、575bp、383bp、343bp（图2）。
图1 5组目的基因片段
图2 酶切后三种基因型
3.统计学处理：所有数据输入计算机，用SPSS软件包处理。结果以均数±标准差(±s)表示。相关性分析采用多元线性回归分析方法，计算回归系数（r）值。计量资料采用方差分析，计数资料采用卡方（χ2）检验，P<0.05为差异有显著性。
结果
1.CHD与正常对照组β HaeⅢ多态性分布频率（%）：两组比较差异有显著性（P<0.01），见表1。
表1 CHD组与对照组β HaeⅢ多态性频率(%)
β HaeⅢ
基因型 CHD组**(66例） 对照组(53例)
男 女 男 女
H1H1 31（56.3） 5（45.4） 26（83.9） 15（68.2）
H1H2 20（36.4） 6（54.6） 4（12.9） 7（31.8）
H2H2 4（7.3） 1（3.2）
合计 55（100） 11（100） 31（100） 22（100）
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